Методы оценки нарушений клеточного иммунитета


Еще несколько лет назад не были известны методы, с помощью которых можно было бы оценить реакции клеточного иммунитета in vitro. В настоящее время эти методы разработаны, усовершенствованы и широко используются в клинической иммунологии. Следует отметить четыре направления для оценки Т-звена иммунной системы: 1 - доказательство непосредственной реакции между Т-клеткой и антигеном; 2 - выявление характерных изменений Т-клетки под влиянием антигенного стимула; 3 - определение активности медиаторов иммунного ответа как проявление реакции между Т-клеткой и антигеном; 4 - доказательство воздействия Т-лимфоцитов на антигенсодержащие клетки.

Связывание антигена на лимфоцитах
. Эта самая распространенная техника предполагает использование меченого антигена (радиоактивная или флюоресцентная метка). Присутствие антигена на поверхности лимфоидных клеток определяют с учетом необходимых приемов контроля. Предварительная обработка эритроцитов исследуемым антигеном дает возможность оценки антигеннесущих лимфоцитов в специфической реакции розеткообразования. Эти методы назначают при ревматоидном артрите (эритроциты, обработанные экстрактом, полученным из синовиальной жидкости, или сенсибилизированые антиэритроцитарными антителами), при болезнях щитовидной железы, лекарственной аллергии и туберкулезе. Прямой тест розеткообразования был описан при Rh-сенсибилизации (D-эритроциты), аутосенсибилизации, вызванной тромбоцитами, при гистонесовместимости (тромбоциты как носители EL-антигенов), а также при бактериальной сенсибилизации (адгезия).

Иммунный ответ стимулированных лимфоцитов. Общеизвестен факт, что антигенная стимуляция приводит к изменению метаболизма, синтеза белка сенсибилизированных клеток. Основными показателями этих процессов служат активация синтеза ядерной ДНК и РНК, а также продукция медиаторов.

1. Реакция бласттрансформации лимфоцитов in vitro (РБТЛ). Исследуемую суспензию лимфоцитов больных (или экспериментальных животных) культивируют в присутствии соответствующего антигена (или митогена). Под воздействием антигена (или митогена) происходит стимуляция лимфоцитов, их трансформация в бласты, что можно оценить морфологически или с помощью изотопной метки. В РБТЛ используют лимфоциты периферической крови, лимфатических узлов или селезенки. Особое значение уделяют условиям культивирования (состав культуральной среды, рН, температура).

Для морфологической оценки наиболее оптимальна окраска Паппенгейма. Критериями трансформации лимфоцитов являются увеличение диаметра клетки и размеров ядра, многочисленные ядрышки, базофилия цитоплазмы с просветленным перинуклеарным пространством. Определенную сложность представляет дифференцирование бластных форм от макрофагов: с этой целью в клеточную суспензию добавляют частицы полистирена, которые фагоцитируются только макрофагами. Для определения процента бластов подсчитывают в общей сложности 500-1000 клеток. Кроме того, для оценки РБТЛ используют изотопную метку; в культуру лимфоцитов добавляют тимидин, меченный 3Н и 14С (синтез ДНК), цитидин или уриДин, меченные 3Н (синтез РНК), лейцин, меченный 14С (синтез белка). Клетки тщательно отмывают. После этого с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика определяют активность реакции по включению изотопа в синтез ДНК, РНК и белка. Результаты можно учитывать и с помощью цитофлюорографии: с этой целью в культуру лимфоцитов добавляют флюорохром (например, этидиумбромид), который служит индикатором процессов обмена, происходящих в ядре.

При высокой степени сенсибилизации включение изотопа повышается в 102-103 раз. Следует учесть, что используемый антиген может оказывать токсическое или неспецифическое стимулирующее действие, поэтому необходимы соответствующие способы контроля. В этом качестве служат культуры лимфоцитов: а - больных без добавления антигена (или с внесением сходного); б - здоровых лиц с добавлением антигена. Степень спонтанной трансформации, лимфоцитов составляет около 1%.

Области практического применения РБТЛ:

- доказательство клеточной сенсибилизации. РБТЛ - довольно чувствительный метод. Положительный результат может быть получен при сенсибилизации доноров низкой дозой (0,001 мкг) туберкулина или дифтерийного токсоида. Высокий уровень стимуляции лимфоцитов был выявлен при бактериальных, вирусных, грибковых, протозойных и других видах гетерологичной сенсибилизации (белки животного происхождения, конъюгаты гаптен-белок, лекарственные препараты, пищевые продукты, пыльца), а также при аутосенсибилизации (ревматоидный артрит, гепатит, тиреоидит);

- тестирование на гистосовместимость (смешанные культуры лимфоцитов);

- оценка функциональной активности лимфоцитов. В данном случае РБТЛ ставят с митогеном ФГА (неспецифическая стимуляция).

К недостаткам метода следует отнести значительную продолжительность реакции. Все попытки сократить время культивирования не привели к воспроизводимым результатам.

2. Продукция лимфокинов. В первую очередь это относится к факторам, ингибирующим миграцию макрофагов и лейкоцитов.

Реакция торможения миграции макрофагов
(РТММ). Известно, что выделение макрофагов у человека представляет определенную сложность, поэтому данный метод ограничен экспериментальной моделью. Применение РТММ в клинике стало возможным, когда было показано, что лимфоциты человека в присутствии антигена синтезируют МИФ морской свинки. Капиллярный метод, предложенный George и Vaughan, получил признание и широкое распространение.

Для выделения макрофагов морской свинке внутрибрюшинно вводят парафиновое масло или гликоген. В образовавшемся экссудате около 60% макрофагов, остальное содержимое лимфо- и гранулоциты. Предварительно отмытыми клетками заполняют капилляры (при непрямом варианте метода они служат только в качестве индикаторов). Капилляры помещают в среду для культивирования, содержащую смесь: лимфоциты + антиген. Подготовленные таким образом специальные платы с ячейками инкубируют при 37 °С в течение 24-48 ч. Часть макрофагов диффузно мигрирует из капилляра: результаты оценивают по площади этой миграции. Признаком торможения реакции служит уменьшение площади миграции макрофагов относительно контроля. Одной из модификаций является способ, при котором макрофаги мигрируют из капли агарозы.

Относительно новые данные свидетельствуют о возможности продукции МИФ стимулированными В-лимфоцитами, поэтому интерпретация положительных результатов в плане клеточно-опосредованной сенсибилизации довольно проблематична.

РТММ была использована для выявления иммунного ответа к возбудителям инфекций, для доказательства аутосенсибилизации, а также для определения степени гистосовместимости.

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) представляет собой модификацию РТММ. В ней применяют лейкоциты периферической крови. Капилляр заполняют предварительно отмытой суспензией лейкоцитов и аналогично прямому тесту РТММ помещают в культуральную среду, содержащую антиген. В течение 24-часовой инкубации при 37 °С лейкоциты мигрируют из капилляра примерно на 6-10 мм. Преимуществом теста является сокращение времени инкубации до 24 ч. Воспроизводимость реакции ниже, чем у непрямого варианта РТММ. Наиболее оптимальный вариант для рутинной техники- реакция миграции лейкоцитов в агарозе. Феномен торможения миграции лейкоцитов опосредован ФУЛ, который вырабатывается, по-видимому, Т- и В-клетками. Этот метод был успешно использован при бактериальных инфекциях, ауто- и контактной сенсибилизации, лекарственной аллергии, реакциях трансплантационного иммунитета и опухолевых процессах.

Тест оценки электрофорегической подвижности макрофагов. В данном случае индикатором продукции лимфокинов служит подвижность макрофагов в электрическом поле. Преимущества теста: усовершенствованный способ количественной оценки результатов, высокая воспроизводимость; недостаток - необходимость дорогостоящей технической аппаратуры. За кинетику макрофагов ответствен MSF.

Оценка действия иммунокомпетентных клеток на антигенсодержащие клетки. Значение этого исследования состоит в том, что с помощью тест-системы можно доказать предполагаемую роль патогенетических механизмов клеточного иммунитета. Применение цитотоксического теста ограничено теми ситуациями, когда антиген - составная часть жизнеспособной культивируемой клетки. Цитотоксический эффект реализуется при добавлении сенсибилизированных лимфоцитов в культуру клеток, содержащих антиген. Реакцию оценивают путем подсчета погибших клеток (суправитальное окрашивание) или по степени включения изотопа в синтез белка (аминокислоты или ДНК клеточных ядер, меченные 14Q). Убедительны те положительные результаты, при которых лимфоидные клетки не содержали примеси сыворотки, так как В-лимфоциты, сенсибилизированные антителами, могут указывать цитотоксическое действие.


Еще по теме:


Ваше имя:
Защита от автоматических сообщений:
Защита от автоматических сообщений Символы на картинке: