Методы выявления IgE-антител


Известны два подхода к обнаружению IgE-антител: 1) количественное определение IgE; 2) доказательство сенсибилизации, основанной на активности IgE-антител. Как при количественных, так и при функциональных тестах для определения активности IgE используют антисыворотку против IgE. Источником такой сыворотки может служить кровь больных IgE-миеломой.

Наряду с этим применяют гетерологичную сыворотку, полученную путём иммунизации экспериментальных животных.

Радиальная иммунодиффузия. С помощью метода Манчини можно определить лишь минимальные концентрации-1 -10 мг/л. Применяя антисыворотку в большем разведении с высокой степенью авидности или полимеры, добавляемые в агар, можно выявить IgE в концентрациях до 0,4 мг/л.

Rowe предложил метод, чувствительность которого была повышена в 10 раз. Он воспроизводил реакцию антиген - антитело, добавляя в агар меченную изотопом антисыворотку (радиоиммунодиффузия). Аналогичным образом используют метку с флуоресцентными красителями. Довольно четкие полосы преципитации регистрируют в реакциях, если к исследуемой пробе добавляют в качестве индикатора небольшое количество меченного изотопом IgE (граница чувствительности - 50 мкг/л). В упрощенной модификации метода в агар вносят анти-IgE-сыворотку, одни лунки заполняют IgE определенной концентрации (стандарты), а другие - образцами сывороток больных.

Радиоиммуносорбентный тест (РИСТ). Для воспроизведения этого теста необходимо располагать 125I-IgE и сывороткой анти-IgE, ковалентно связанной с такими нерастворимыми веществами, как декстран, сефадекс или целлюлоза. В основе определения IgE в исследуемых секретах и сыворотках лежит принцип торможения реакции между ls5I-IgE и иммуносорбентами, содержащими сыворотку анти-IgE. Полученные результаты сопоставляют с разведениями IgE известной концентрации (количественный учет реакции). С помощью этого метода можно выявить IgE в концентрации 1-5 мкг/л. Максимальная чувствительность находится в пределах 5-100 мкг/л. В качестве модификации используют технику, при которой иммуносорбенты в течение 16 ч преинкубируют либо со стандартом, либо с исследуемой пробой, а затем в течение 2-4 ч - с меченым IgE, что повышает чувствительность метода.

Сэндвич-метод по Саtt состоит в том, что внутреннюю поверхность маленькой полистироловой трубочки обрабатывают очищенным IgE, а затем добавляют сыворотку анти-IgE. После основательной отмывки эти трубочки с «активированной анти-IgE» используют для теста торможения, аналогичного РИСТ.

Иммуноферментный метод ELISA также используют для обнаружения IgE (метка пероксидаза или галактозидаза).

Применение моноклональных антител позволило значительно усовершенствовать способ определения IgE и повысить воспроизводимость теста. Модификации известных методов на основе применения радиоактивной метки, подбора микродоз материала, соответствующего носителя, создали предпосылки для «ультрачувствительного» теста.

Методы выявления атопической сенсибилизации. В последние годы были разработаны и усовершенствованы уже известные внутрикожные пробы. Тест-реакции воспроизводят как у лиц, страдающих атопическими заболеваниями, так и у пассивно сенсибилизированных здоровых (по Прауснитцу - Кюстнеру). Реакция антиген - антитело положена в основу этих методов. Многие авторы в целях клинической диагностики сопоставляли результаты разных тест-реакций, однако попытки выявить возможные корреляции не всегда оказывались успешными.
 
Методы in vivo. Принцип реакции Прауснитца - Кюстнера и ее модификаций состоит в переносе реагинсодержащей сыворотки здоровым лицам, что вызывает местную реакцию антиген - антитело в виде характерного волдыря и эритемы. Данную реакцию рассматривают как полуколичественный метод; она отличается высокой чувствительностью: положительный результат возможен при очень низких концентрациях реагина (около 1 мг/л) при титре антител 1 : 10 000.

Все проводимые манипуляции требуют соблюдения стерильных условий. Необходимо исключить гепатит и другие инфекции. В качестве реципиента выбирают члена семьи или другого добровольца, не страдающего аллергией.

1. Прямой тест: 0,1 мл тест-сыворотки вводят внутрикожно в область предплечья или спины реципиента. Нередко после этого появляется местное покраснение, которое обычно проходит к моменту аппликации аллергена. Через 48 ч в то же самое место внутрикожно вводят 0,1 мл предполагаемого аллергена. Поскольку реагины высокоаффинны относительно клеточных мембран, они диффундируют не более чем на 1 см от места аппликации. Это предотвращает опасность генерализованной аллергической реакции. Контролями служат следующие тесты: аппликация аллергена на участок кожи, не обработанный антителами, и введение аллергена в кожу, обработанную сывороткой данного больного или здорового лица. В случае положительной реакции через 20-30 мин после контакта с аллергеном развивается характерная местная реакция с образованием волдыря и с гиперемией.

2. Модификации. Если необходима длительная стимуляция, то аллерген вводят физиологическим путем (например, per os). При этом в отдельном исследовании определяют степень влияния лекарственных и пищевых аллергенов на процессы метаболизма.

При тесте нейтрализации сыворотку пациента предварительно инкубируют в равных объемах с разными разведениями экстракта аллергена в течение 5 ч при комнатной температуре. Кожу больного обрабатывают путем введения 0,1 мл этой смеси. Через 48 ч в то же самое место внутрикожно вводят аллерген. Определяют тот состав смеси, при котором возможна полная нейтрализация, т. е. отсутствует сенсибилизация кожи.

Методы in vitro. Феномен высвобождения гистамина. Уже в 1941 г, Katz и соавт. установили, что добавление экстракта пыльцы к крови больных поллинозом приводит к увеличению содержания гистамина в плазме. Однако лишь с помощью модификации Lichtenstein и соавт. был разработан метод, который используют как для доказательства реагинзависимой сенсибилизации, так и для оценки неспецифических факторов. Суспензию лейкоцитов добавляют к равному объему аллергена, взятого в разных разведениях. Данную смесь инкубируют в течение 60 мин при 37 С. После этого учитывают свободный гистамин. В отдельных контрольных опытах после цитолиза (например, хлорной кислотой) определяют общее содержание гистамина в клетках. Этот метод используют в следующих целях:

1. Доказательство сенсибилизации и определение ее степени. При добавлении к суспензии клеток разных концентраций антигена можно вывести кривую дозовой зависимости. Если концентрация антигена превышает оптимальную, то наступает торможение реакции высвобождения гистамина. Те дозы, которые приводят к 50% высвобождению гистамина, рассматривают как показатель «клеточной чувствительности» по Lichtenstein. Сенсибилизация путем введения белка уже достаточна для реакции высвобождения гистамина, Обычно не обнаруживают четких корреляций между общим содержанием гистамина в лейкоцитах и наличием или отсутствием аллергических проявлений. Однако многие авторы отмечают взаимосвязь между показателем клеточной чувствительности и степенью тяжести заболевания.

2. Оценка активности аллергена. При добавлении набора аллергенов к клеточной суспензии одного и того же донора можно определить биологическую активность разных препаратов. Данный метод рекомендуют для стандартизации экстрактов аллергенов.

3. Определение относительной концентрации специфических IgE-антител. С этой целью используют технику пассивной сенсибилизации. Установлено, что лейкоциты здоровых лиц могут быть пассивно сенсибилизированы in vitro, а после контакта с аллергеном выделяют гистамин. Применение этого метода ограничено в связи с тем, что не все образцы лейкоцитов могут быть пассивно сенсибилизированы. Путем сенсибилизации сывороткой, взятой в разных разведениях, определяют те из них, которые при оптимальной концентрации аллергена приводят к 50% высвобождению гистамина.

Прямой метод выявления специфических IgE-антител. Аллерген соединяют с частицами сорбента-носителя, а затем добавляют к исследуемой сыворотке. Если в ней содержатся соответствующие антитела, то они взаимодействуют с конъюгатом. После удаления всех несвязанных компонентов сыворотки в смесь реагентов вносят антисыворотку против IgE, меченную 1251. В том случае, если произошло связывание реагина с антигеном, молекулы анти-IgE взаимодействуют с реагином.

Степень радиоактивности частиц служит мерой IgE-молекул, реагирующих с исследуемым аллергеном. В соответствии с этим описанием была исследована стандартная сыворотка больного поллинозом (аллергия к пыльце березы), которая оказалась положительной при 4-кратном разведении.

Многочисленные модификации метода направлены главным образом на возможность обнаружения абсолютного количества антител, что важно для клинической практики. Специфичность реакции можно проверить с помощью блокирующего эффекта растворимого аллергена.

В качестве носителя используют сефадекс, активированный цианоген-бромидом, или целлюлозу. Широкое применение нашли разработанные ВОЗ стандарты с указанием количества специфических IgE-антител. На основании образцов этих стандартов можно оптимизировать оценку результатов, которая при общепринятой технике PACT вызывает определенные трудности.

Преимущества PACT:

- безопасность для пациентов;

- независимость от медикаментозной терапии;

- возможность количественной оценки;

- отсутствие ложноположительных и ложноотрицательных результатов при кожных пробах;

- возможность анализа антител класса IgG с помощью соответствующих модификаций (меченая сыворотка анти-IgG, белок А стафилококка). Недостатки PACT:

- меньшая чувствительность по сравнению с кожной пробой;

- недостаточно удовлетворительное качество стандартизации;

- возможное влияние антител класса IgG (десенсибилизация);

- значительная продолжительность реакции (оценка результатов возможна лишь через 48 ч);

- использование дорогостоящих приборов и препаратов.

IgG-интерференцию можно предотвратить следующими способами:

- повышением степени связывания аллергена на носителе;

- предварительной элиминацией IgG (белок А стафилококка или другие иммуносорбенты).

Кроме того, возможности метода ограничены тем, что связывается, как правило, только определенное количество аллергена, но его точная масса остается неизвестной. Отсюда следует, что метод можно считать полуколичественным.

Сэндвич-техника по Zеiss не учитывает влияния антител, не относящихся к классу IgE. «Сэндвич» состоит из полистирола, IgE кроличьей сыворотки, анти-IgE исследуемой сыворотки (специфические IgE) и аллергена, меченного изотопом, взятого в разных разведениях. Связывание антигена при его разных разведениях позволяет выяснить максимальную способность сыворотки связывать антиген. Исходя из этого, рассчитывают абсолютную концентрацию специфических IgE-антител. Для воспроизведения данного теста необходим набор очищенных и меченых аллергенов, что представляет определенную техническую сложность.

PACT - это оптимальный метод для стандартизации активности аллергенов. При прямом варианте происходит связывание разных концентраций исследуемого экстракта на носителе, что и определяет результаты теста. Проявление связанной с носителем радиоактивности сравнивают с концентрацией аллергена в полулогарифмической системе. Максимальное значение ограничено концентрацией специфических антител IgE в сыворотке больного. Концентрацию, при которой происходит 50 % связывание, принимают за единицу отсчета. При непрямом варианте теста образцы сыворотки предварительно смешивают с экстрактом аллергена и только после этого воспроизводят общепринятую технику. Происходит снижение показателей PACT: в данном случае определяют те разведения аллергена, которые наполовину подавляют связывание IgE на носителе. Прямой метод может быть использован для доказательства наличия специфического компонента в гетерогенной смеси.

Модификации теста связаны с применением моноклональных антител (с более высокой специфичностью и воспроизводимостью реакций), совершенствованием техники изотопной метки, выбором оптимального материала для носителя с целью максимального связывания аллергена.

Иммуноферментный метод. Антиген в соответствующих разведениях связывают на полистироле (микроплаты для титрования). После основательного отмывания добавляют исследуемую сыворотку и снова отмывают реагенты. Затем смесь инкубируют с сывороткой, меченной пероксидазой. После очередного отмывания добавляют фенилендиамин и с помощью фотометра определяют цветовой показатель реакции. Чем выше степень связывания IgE, тем интенсивнее окрашивание. Преимущества теста: стабильность меченой сыворотки в течение нескольких месяцев и невысокие расходы на реактивы. Наряду с пероксидазой используют также щелочную фосфатазу и 8-галактозидазу.

Иммуноблоттинг. Эта техника представлена серией методов, при которых экстракт аллергена (антигена) «разгонят» в геле, полученные фракции переносят на нитроцеллюлозу и иммобилизуют для детального анализа аллергена. В перспективе могли бы иметь практическое значение методы, когда исследуемый аллерген связывают на соответствующем носителе (нитроцеллюлоза) и после инкубации с сывороткой больного оценивают средствами иммуноферментного анализа. В результате появилась бы возможность учета целого спектра сенсибилизирующих компонентов.

Иммунофлюоресценция может быть предназначена и для включения в PACT. В качестве носителя используют микроплаты или частицы, в качестве тест-антител - обычно сыворотку анти-IgE, меченную ферментом (например, фосфатазой). Окончательно добавляют соответствующий флюорогенный субстрат и с помощью флюорометрии учитывают результаты реакции.

Реакция антиген - антиглобулин на эритроцитах. Основной методический подход - это связывание предполагаемого антигена с кроличьими антителами к эритроцитам человека. Полученный таким образом реагент может специфически взаимодействовать с поверхностью эритроцитов, не вызывая при этом их агглютинацию (связывание реагента на эритроцитах). Приготовленные указанным способом эритроциты инкубируют с исследуемой сывороткой. Если сыворотка содержит IgE-антитела соответствующей специфичности, то после добавления анти-IgE это приводит к агглютинации. Недостаток метода: возможность связывания на поверхности эритроцитов лишь незначительного количества аллергена.

Читать далее Причины IgE-обусловленной аллергии



Ваше имя:
Защита от автоматических сообщений:
Защита от автоматических сообщений Символы на картинке: