Методы оценки гистосовместимости


Совершенствованию методов подбора совместимого донора при трансплантации уделяется особое внимание. Степень гистосовместимости донора и реципиента оценивают с помощью трех методических подходов: типирования тканей, тестов для непосредственного доказательства гистосовместимости и иммунологических реакций для подтверждения существующей сенсибилизации.

Типирование тканей. Цель этих методов - по возможности точная идентификация антигенов донора и реципиента. В зависимости от характера реакций различают SD-антигены, контролируемые локусами А, В, С и DR, а также антигены D-локуса, определяемые в реакции MLC (LD-антигены).

А, В, С, DR-типирование. Методы выявления антигенов, контролируемых локусами А, В, С и DR, основаны на использовании моноспецифических антисывороток. Источником типирующих тест-сывороток могут быть следующие:

- сыворотки лиц с множественными гемотрансфузиями. При менее 5 переливаниях крови антилейкоцитарные антитела вырабатываются в 50% случаев, при более 20 трансфузиях - у 89 % лиц. Однако эти сыворотки большей частью полиспецифичны;

- сыворотки много рожавших женщин. Специфические антитела обнаруживают у 25 % женщин, начиная с 24-й недели беременности. Преимущество этих сывороток состоит в том, что антитела вырабатываются только к антигенам отца, по которым отсутствует гистосовместимость в системе мать-плод;
 
- сыворотки специально сенсибилизированных лиц. Добровольцам пересаживают трансплантат кожи либо вводят внутри или подкожно суспензию лейкоцитов от несовместимого донора.

Для выявления реакции моноклональные антитела сывороток с антигенами гистосовместимости используются следующие методы.

1. Реакция лейкоагглютинации. Феномен агглютинации наблюдают после добавления исследуемой антисыворотки к суспензии лейкоцитов. Следует иметь в виду возможность ошибок, поскольку в реакции могут участвовать гранулоциты и их специфические антитела.

2. Цитотоксический тест. Оценивают цитотоксическое влияние сывороток (антител) на лимфоциты. Учет погибших клеток производят с помощью фазово-контрастной микроскопии, витальной окраски клеток (трипановый синий и эозин Y) и флюорохромными красителями, а также посредством изотопной метки. Основной модификацией служит микрометод. Кроме того, тест предполагает использование как свежих, так и консервированных путем замораживания лимфоцитов периферической крови и лимфатических узлов. Известен одноступенчатый метод Kissmeyer-Nielsen (KN-тест), когда лимфоциты инкубируют с комплементом и антисывороткой. Terasaki разработал двухступенчатый тест (NIH): предварительная инкубация клеток с антисывороткой, добавление комплемента и последующая инкубация смеси.

Известны наблюдения, когда при типировании цитотоксический тест оказывается отрицательным, а реакция агглютинации положительной (CNAP). Этот феномен можно объяснить тем, что для активации комплемента имеет значение локализация антигена. Кроме того, описаны случаи, когда были положительными только абсорбционные пробы.

3. Реакция связывания комплемента на лейкоцитах или тромбоцитах. Тромбоциты относительно долго сохраняют антигенные свойства, что является преимуществом теста, однако на них отсутствуют некоторые антигены гистосовместимости. В этом состоит недостаток метода по сравнению с лимфоцитотоксическим тестом.

Принцип типирования - подбор совместимого донора - соответствует цели определения группы крови при гемотрансфузии. У совместимого донора не должно быть антигенов, которые отсутствуют у реципиента. Более точный метод подбора - идентификация гаплотипов, что связано прежде всего с семейным генетическим анализом.

Результаты типирования зависят от качества тест-сывороток. Иногда в распоряжении исследователей находятся образцы поливалентных сывороток, а антисыворотки для определения частных специфичностей отсутствуют. Эти обстоятельства ограничивают возможности методов типирования тканей.

Разработка серологических методов идентификации DR-антигенов повысила шансы успешной пересадки  трупного органа.

D-типирование. Одним из видов реакции MLC, с помощью которой осуществляют подбор по D-антигенам, является тест с использованием лимфоцитов лиц, гомозиготных по D-локусу.

Используя соответствующую модификацию, можно было бы применять в тест-системе спермин, однако они несут только один гаплотип. Клетки с другим гаплотипом элиминируются с помощью цитотоксических антисывороток.

Другим вариантом D-типирования с помощью MLC является реакция примированных лимфоцитов по типу вторичного иммунного ответа.

Примированные лимфоциты получают реакции MLC: клетки лица А стимулируют обработанными митомицином клетками лица В (Вm), которые отличаются от А по одному гаплотипу (например, родители или дети лица А). Через 9-14 суток культура лимфоцитов состоит преимущественно из популяции отвечающих клеток, в то время как нестимулированные клетки большей частью нежизнеспособны. Если примированные лимфоциты вновь культивировать с Вm- или другими клетками, которые содержат те же самые LD-антигены, то уже через 24-48 ч можно наблюдать усиленную стимуляцию (вторичный ответ).

Подобные исследования особенно результативны при обследовании многодетных семей. Обычно воспроизводят тест-систему, в которой клетки детей реагируют с лимфоцитами родителей или братьев и сестер, идентичных по одному гаплотипу.

Преимущества PLT:
- типирование осуществляют всего за 24 ч;
- определяется не только степень совместимости донора и реципиента, но и тип LD;
- нет необходимости в использовании клеток от гомозиготных лиц (редкий тип клеток).

Способы выявления несовместимости тканей. С помощью иммунологических методов in vitro и in vivo можно сделать вывод о степени гистосовместимости обследуемых лиц. Особое значение имеют следующие тесты.

1. MLC. Выделенные лимфоциты донора и реципиента смешивают и культивируют. Показателем несовместимости двух партнеров по Н-антигенам служит двунаправленная стимуляция клеток с трансформацией их в бласты. Этот процесс можно оценить по активности включения 3Н-тимидина. В принципе речь идет о РБТЛ как донора, так и реципиента. При выборе наиболее совместимого донора уровень РБТЛ должен быть минимальным. Практические выводы можно сделать только при условии однонаправленной культуры. С этой целью лимфоциты донора обрабатывают митомицином, тем самым блокируя их способность к бласттрансформации с сохранением антигенных свойств. Если совместно культивировать лимфоциты АВm, то А-клетки выступают в роли отвечающей популяции клеток, а Вm - стимулирующей. В качестве контроля служит культура клеток ААm. Согласно новым данным, клетки, обработанные митомицином, еще способны к продукции бластогенного фактора, что ставит под сомнение факт строгой однонаправленности MLC.

Значительное преимущество данного теста состоит в том, что он позволяет выявлять те антигенные различия, которые не удается определить с помощью серологических методов типирования. Недостаток теста - продолжительный период времени, необходимый для оценки результатов (несколько дней), что особенно значимо при трансплантации трупного органа.

2. Клеточно-опосредованный лимфолизис, CML. Общепринятая реакция MLC продолжается в течение 4-5 дней. За это время стимулирующие клетки отмирают, а популяция отвечающих клеток персистирует. Полученные таким способом сенсибилизированные лимфоциты (клетки-киллеры) вносят в культуру с клетками-мишенями, меченными 51Сг, которые предварительно в течение 72 ч стимулировали митогеном ФГА. Через 3-4 ч оценивают цитолиз по выходу 51Сг (влияние киллеров на клетки-мишени).

Цитотоксичность выражена больше, если стимулирующая популяция и клетки-мишени получены от одного и того же донора, а также при различиях по сумме антигенов LD и SD.

3. Тест на «третьем партнере». Ткань реципиента пересаживают добровольцу, не состоящему с ним в родстве. После реакции на трансплантат сенсибилизированному добровольцу пересаживают кожный лоскут от предполагаемого донора. В результате наблюдают ускоренное отторжение трансплантата по типу вторичного иммунного ответа. Характер этой реакции зависит от степени гистосовместимости донора и реципиента. При идентичности антигенных структур (однояйцовые близнецы) у добровольца развивается сверхострое отторжение кожного лоскута по типу «белого трансплантата», при пересадке ткани от неидентичных близнецов возможен переходный характер реакции от вторичной к первичной. В настоящее время этот метод в клинической практике не используют.

В дальнейшем было предложено заменить пересадку кожного лоскута внутрикожной инъекцией суспензии лимфоцитов. При несовместимости реципиента и предполагаемого донора может развиваться местная РТПХ. При этом имеют значение такие факторы, как различия по АВО-системе, полу, чувствительности кожи, однако апробация в клинике не привела к убедительным результатам.

Следует подчеркнуть, что, несмотря на информативность, общим недостатком указанных методов является продолжительность их постановки (несколько дней), поэтому часто предпочтение отдается более оперативным методам.

Доказательство сенсибилизации организма. Получить доказательства предсуществующей сенсибилизации можно на основании перекрестных реакций сыворотки реципиента с образцами лейкоцитов доноров. Выявление цитотоксических антител к клеткам предполагаемого донора указывает на необходимость выбора другого партнера и тем самым способствует снижению показателя сверхострых отторжений. Антитела к Н-антигенам обнаруживают более чем у 30 % населения, что связано прежде всего с переливанием крови и беременностью. Не исключена сенсибилизация и перекрестно реагирующими антигенами (например, бактерий).

Наряду с комплементзависимым лимфоцитотоксическим тестом в клинической практике используют реакцию, основанную на феномене АЗКЦ. В качестве реагентов служат: сыворотка реципиента (источник антител, как полагают, к клеткам-мишеням), лимфоциты донора (клетки-мишени) и пул лимфоцитов здоровых лиц (клетки-эффекторы). При положительной перекрестной пробе вероятность развития сверх острого отторжения трансплантата составляет около 80 %. Вместе с тем то обстоятельство, что со временем титр циркулирующих антител снижается, а способность к вторичному ответу (клетки памяти) остается, во многом ограничивает информативность метода.

Некоторые авторы пытались выявить различия между активностью антител Т- и В-клеточной специфичности. Они исходили из того, что антитела к антигенам на В-клетках должны обладать выраженной защитной функцией. Тем не менее фактические результаты отличались от ожидаемых: количество функционирующих в течение одного года трансплантатов составило 54 % при отрицательной пробе и 25 % при положительной.

Группа исследователей во главе с Terasaki для выявления у реципиента цитотоксических антител использовали лимфоциты 90 произвольно выбранных доноров. Так была разработана следующая классификация (в скобках - показатели функционирующих трансплантатов спустя 6 месяцев после операции):

1. Отсутствие цитотоксических антител в течение:
- 12 и более месяцев (87%);
- 6-12 месяцев (74%);
- 6 месяцев (53%).

2. Положительный тест:
- с поражением 5-50 % тест-лимфоцитов (40 %);
- с поражением более 50% тест-лимфоцитов (26%).

Одновременно целесообразно проводить следующие рутинные тесты:
- определение групп крови донора и реципиента по антигенам AB0;
- определение Н-антигенов донора и реципиента;
- оценка гистосовместимости с помощью реакции MLC;
- исследование существующей сенсибилизации реципиента к Н-антигенам донора.

Широкое внедрение методов типирования в клиническую практику привело к улучшению результатов трансплантации, удлинению сроков приживления трансплантата от донора не родственника. Расчет исходных данных показал, что если принимать во внимание пять иммунологических показателей, то можно составить «лист ожидания» для 20 потенциальных реципиентов. Если же учитывать 10 характеристик, то для «листа ожидания» необходимо 100 больных. При этом возрастает риск отсутствия совместимого донора в данном городе или в пределах страны. Так возникла необходимость в создании международных объединений с картотекой «листов ожидания» и службой обмена органами для трансплантации.



Ваше имя:
Защита от автоматических сообщений:
Защита от автоматических сообщений Символы на картинке: