Характеристика роли стрептококковой гиалуронидазы в развитии инфекционного процесса
При изучении динамики стрептококковой инфекции было уделено внимание вопросу о возможной роли в развитии инфекционного процесса ферментных систем возбудителя, обладающих выраженной биологической активностью. Их объединяют под общим названием "токсинов частного приложения", поскольку действие указанных веществ проявляется наиболее наглядно в отношении отдельных тканей организма или их составных частей. В последние годы накопились данные и о более широком спектре их влияния на организм.
Не останавливаясь на этом вопросе, нужно указать, что с точки зрения развития инфекционного процесса наибольший интерес представляла стрептококковая гиалуронидаза, которую рассматривают как фактор инвазивности. На различных экспериментальных моделях было показано усиление распространения микробов в организме и ускорение всасывания различного рода веществ под влиянием гиалуронидазы. Подобного рода исследования, проведенные нами несколько лет назад, также показали, что фермент значительно ускоряет поступление в кровь различных антигенов, введенных подкожно (были испытаны различные антигены - корпускулярные и лизированные, микробного и немикробного происхождения).
На модели экспериментальной паратифозной инфекции белых мышей мы могли установить, что гиалуронидаза резко отягощала инфекционный процесс при подкожном введении ее в смеси с микробной взвесью. Это выражалось в значительно более раннем и массивном обсеменении животных опытной группы (зараженных микробами в смеси с гиалуронидазой) и в значительно большей их гибели. В то же время не удалось выявить какого-либо отрицательного (или положительного) действия гиалуронидазы на течение экспериментальной стрептококковой инфекции, что составляло нашу основную задачу. При этом в отличие от прежних опытов, в которых применялся частично очищенный сухой препарат бычьей тестикулярной гиалуронидазы, была использована очищенная стрептококковая гиалуронидаза, приготовленная из культуры гемолитического стрептококка IV серологического типа 2. В преобладающем большинстве опытов вводимая доза фермента составляла 500 усл. ед., так как в предварительных титрационных испытаниях было установлено, что такая доза является наиболее эффективной (в отношении ускорения всасывания антигенов). В отдельных опытах концентрация фермента увеличивалась в 2- 4 раза (1000-2000 усл. ед.).
Для заражения мышей применяли культуру гемолитического стрептококка I серологического типа, многократно проведенную через мышь и обладавшую, в силу этого, высокой вирулентностью. (Смертельная доза была в пределах нескольких десятков клеток). Материалом для заражения служила эмульсия из селезенки мышей очередного пассажа, погибших от стрептококкового сепсиса, эмульсии готовили на нормальной лошадиной сыворотке, разведенной 1 : 200, для стабилизации числа жизнеспособных микробов в материале, применяемом для заражения. Опыты проводили по следующим схемам: а) подкожное заражение в смеси с ферментом; б) подкожное заражение раздельно от фермента, т. е. введение микробов в предварительно обработанные гиалуронидазой участки тканей (в разных опытах обработка проводилась в разные сроки - от 30 мин до 24 ч перед заражением); в) внутривенное заражение и вслед за ним внутрибрюшинное введение фермента.
Мышей делили на две равные группы: мыши одной из них (опытной) получали микробы и фермент (в смеси или раздельно), другой (контрольной) - ту же дозу микробов с добавлением инактивированной гиалуронидазы или физиологического раствора. При подкожном заражении материал вводили в область пахового лимфатического узла или в область спины. В разных опытах применяли различные разведения селезеночной взвеси, поэтому количество микробов в инфицирующей дозе варьировало от нескольких десятков или сотни клеток до десятков тысяч. При учете сроков гибели зараженных мышей, с бактериологическим обследованием павших, были получены во всех этих опытах однотипные результаты: гибель опытных мышей не ускорялась сколько-нибудь заметно по сравнению с контрольными (3-5-е сутки после заражения); не было каких-либо существенных различий и в показателях бактериемии у мышей обеих групп. Таким образом, стрептококковая гиалуронидаза, как в свое время бычья тестикулярная, не оказывала какого-либо отчетливого утяжеляющего влияния на течение стрептококковой инфекции в условиях данного опыта.
В связи с имеющимися указаниями о том, что действие гиалуронидазы наиболее выражено в ранние стадии инфекционного процесса, в части опытов было проведено поэтапное микробиологическое изучение процесса распространения микробов из местного очага. В этих опытах мышей заражали подкожно, в область пахового лимфатического узла, в одних случаях - в смеси с ферментом, в других - микробы вводили в предварительно обработанные ферментом участки ткани. В разные сроки после заражения мышей вскрывали и подвергали тщательному бактериологическому обследованию. Исследовали: местный очаг (подкожная клетчатка в месте заражения), регионарные и контрлатеральные паховые лимфатические узлы (раздельно), глубокие и поверхностные подмышечные лимфатические узлы, селезенку, кровь. При этом оказалось, что в ранние сроки инфекционного процесса (через 6 ч после заражения) местные микробные очаги у контрольных животных (не получивших фермента) были выражены резче, нежели у опытных. Через 24 ч различия в микробиологической характеристике местных очагов сглаживались, но показатели обсемененности отдаленных лимфатических узлов, селезенки и крови у контрольных мышей были выше, чем у опытных. В поздние сроки (48-72 ч после заражения) кривые размножения микробов выравнивались, и исход инфекции (гибель мышей) был одинаковым в обеих группах.
Торможение в развитии микробных очагов, отмечавшееся у "гиалуронидазных" мышей в ранние стадии инфекционного процесса, следует, по-видимому, объяснить защитным действием, которое оказывает гиалуронидаза в отношении инфекции, обусловленной капсульными микробами. Разрушая капсульное вещество (гиалуроновую кислоту) гемолитических стрептококков, гиалуронидаза тем самым способствовала их фагоцитозу. Указания на такое защитное действие гиалуронидазы имеются в литературе. В условиях наших опытов мы могли отметить такое действие гиалуронидазы лишь в начальной стадии инфекционного процесса, причем оно не оказывало влияния на его конечный исход. В связи с полученными данными надлежало вновь проверить действие стрептококковой гиалуронидазы как фактора проницаемости в отношении соединительнотканных барьеров организма. С этой целью были повторены опыты по изучению влияния гиалуронидазы на течение экспериментальной паратифозной инфекции. Заражение белых мышей проводилось по вышеизложенной методике (подкожно, в область пахового лимфатического узла, в смеси с ферментом). Полученные результаты полностью подтвердили данные наших прежних опытов, проведенных с тестикулярным ферментом. Стрептококковая гиалуронидаза резко отягощала течение паратифозной инфекции; в группе опытных мышей (зараженных микробами плюс фермент) количество павших было значительно большим, нежели в контрольной, а сроки гибели - более ранними.
Таким образом, при двух экспериментальных инфекциях с одинаковым типом течения (развитие сепсиса), но вызванных разными возбудителями, действие гиалуронидазы оказалось различным: гиалуронидаза практически не оказывала влияния на течение и исход стрептококковой инфекции и резко отягощала паратифозную. Естественно было полагать, что эти различия в действии гиалуронидазы зависели от разного ее влияния на тот и другой микробный агент.
По-видимому, гиалуронидаза оказывает на стрептококковую инфекцию "двойное действие": с одной стороны, способствует продвижению микробов из местного очага через соединительнотканные барьеры организма (как и при паратифозной инфекции), с другой - повреждает защитную капсулу и этим облегчает фагоцитоз микробов, что приводит к временному торможению инфекционного процесса на ранних его этапах. Таким образом, в организме зараженных стрептококком мышей гиалуронидаза имеет две разные точки приложения: межуточное вещество соединительной ткани хозяина и гиалуроновую кислоту капсульного вещества паразита. Обе стороны действия гиалуронидазы взаимно противоположны по своей биологической направленности, а поэтому стрептококковый инфекционный процесс, протекающий в присутствии фермента, является, по-видимому, их равнодействующей. Обе стороны в значительной степени уравновешивают друг друга, в силу чего течение и исход стрептококковой инфекции у "гиалуронидазных" мышей практически не отличались от наблюдавшихся в контрольных группах. Следует полагать, что указанное "двойное" действие гиалуронидазы имеет место не только в искусственных условиях эксперимента, во всяком случае в той мере, в какой речь идет о внеклеточном ферменте, который может воздействовать как на ткани организма, так и на составные части микробной клетки.
Полученные данные побудили нас продолжить исследования в направлении изучения роли иных факторов в патогенезе острой стрептококковой инфекции, в частности роли продуктов микробного распада.
Не останавливаясь на этом вопросе, нужно указать, что с точки зрения развития инфекционного процесса наибольший интерес представляла стрептококковая гиалуронидаза, которую рассматривают как фактор инвазивности. На различных экспериментальных моделях было показано усиление распространения микробов в организме и ускорение всасывания различного рода веществ под влиянием гиалуронидазы. Подобного рода исследования, проведенные нами несколько лет назад, также показали, что фермент значительно ускоряет поступление в кровь различных антигенов, введенных подкожно (были испытаны различные антигены - корпускулярные и лизированные, микробного и немикробного происхождения).
На модели экспериментальной паратифозной инфекции белых мышей мы могли установить, что гиалуронидаза резко отягощала инфекционный процесс при подкожном введении ее в смеси с микробной взвесью. Это выражалось в значительно более раннем и массивном обсеменении животных опытной группы (зараженных микробами в смеси с гиалуронидазой) и в значительно большей их гибели. В то же время не удалось выявить какого-либо отрицательного (или положительного) действия гиалуронидазы на течение экспериментальной стрептококковой инфекции, что составляло нашу основную задачу. При этом в отличие от прежних опытов, в которых применялся частично очищенный сухой препарат бычьей тестикулярной гиалуронидазы, была использована очищенная стрептококковая гиалуронидаза, приготовленная из культуры гемолитического стрептококка IV серологического типа 2. В преобладающем большинстве опытов вводимая доза фермента составляла 500 усл. ед., так как в предварительных титрационных испытаниях было установлено, что такая доза является наиболее эффективной (в отношении ускорения всасывания антигенов). В отдельных опытах концентрация фермента увеличивалась в 2- 4 раза (1000-2000 усл. ед.).
Для заражения мышей применяли культуру гемолитического стрептококка I серологического типа, многократно проведенную через мышь и обладавшую, в силу этого, высокой вирулентностью. (Смертельная доза была в пределах нескольких десятков клеток). Материалом для заражения служила эмульсия из селезенки мышей очередного пассажа, погибших от стрептококкового сепсиса, эмульсии готовили на нормальной лошадиной сыворотке, разведенной 1 : 200, для стабилизации числа жизнеспособных микробов в материале, применяемом для заражения. Опыты проводили по следующим схемам: а) подкожное заражение в смеси с ферментом; б) подкожное заражение раздельно от фермента, т. е. введение микробов в предварительно обработанные гиалуронидазой участки тканей (в разных опытах обработка проводилась в разные сроки - от 30 мин до 24 ч перед заражением); в) внутривенное заражение и вслед за ним внутрибрюшинное введение фермента.
Мышей делили на две равные группы: мыши одной из них (опытной) получали микробы и фермент (в смеси или раздельно), другой (контрольной) - ту же дозу микробов с добавлением инактивированной гиалуронидазы или физиологического раствора. При подкожном заражении материал вводили в область пахового лимфатического узла или в область спины. В разных опытах применяли различные разведения селезеночной взвеси, поэтому количество микробов в инфицирующей дозе варьировало от нескольких десятков или сотни клеток до десятков тысяч. При учете сроков гибели зараженных мышей, с бактериологическим обследованием павших, были получены во всех этих опытах однотипные результаты: гибель опытных мышей не ускорялась сколько-нибудь заметно по сравнению с контрольными (3-5-е сутки после заражения); не было каких-либо существенных различий и в показателях бактериемии у мышей обеих групп. Таким образом, стрептококковая гиалуронидаза, как в свое время бычья тестикулярная, не оказывала какого-либо отчетливого утяжеляющего влияния на течение стрептококковой инфекции в условиях данного опыта.
В связи с имеющимися указаниями о том, что действие гиалуронидазы наиболее выражено в ранние стадии инфекционного процесса, в части опытов было проведено поэтапное микробиологическое изучение процесса распространения микробов из местного очага. В этих опытах мышей заражали подкожно, в область пахового лимфатического узла, в одних случаях - в смеси с ферментом, в других - микробы вводили в предварительно обработанные ферментом участки ткани. В разные сроки после заражения мышей вскрывали и подвергали тщательному бактериологическому обследованию. Исследовали: местный очаг (подкожная клетчатка в месте заражения), регионарные и контрлатеральные паховые лимфатические узлы (раздельно), глубокие и поверхностные подмышечные лимфатические узлы, селезенку, кровь. При этом оказалось, что в ранние сроки инфекционного процесса (через 6 ч после заражения) местные микробные очаги у контрольных животных (не получивших фермента) были выражены резче, нежели у опытных. Через 24 ч различия в микробиологической характеристике местных очагов сглаживались, но показатели обсемененности отдаленных лимфатических узлов, селезенки и крови у контрольных мышей были выше, чем у опытных. В поздние сроки (48-72 ч после заражения) кривые размножения микробов выравнивались, и исход инфекции (гибель мышей) был одинаковым в обеих группах.
Торможение в развитии микробных очагов, отмечавшееся у "гиалуронидазных" мышей в ранние стадии инфекционного процесса, следует, по-видимому, объяснить защитным действием, которое оказывает гиалуронидаза в отношении инфекции, обусловленной капсульными микробами. Разрушая капсульное вещество (гиалуроновую кислоту) гемолитических стрептококков, гиалуронидаза тем самым способствовала их фагоцитозу. Указания на такое защитное действие гиалуронидазы имеются в литературе. В условиях наших опытов мы могли отметить такое действие гиалуронидазы лишь в начальной стадии инфекционного процесса, причем оно не оказывало влияния на его конечный исход. В связи с полученными данными надлежало вновь проверить действие стрептококковой гиалуронидазы как фактора проницаемости в отношении соединительнотканных барьеров организма. С этой целью были повторены опыты по изучению влияния гиалуронидазы на течение экспериментальной паратифозной инфекции. Заражение белых мышей проводилось по вышеизложенной методике (подкожно, в область пахового лимфатического узла, в смеси с ферментом). Полученные результаты полностью подтвердили данные наших прежних опытов, проведенных с тестикулярным ферментом. Стрептококковая гиалуронидаза резко отягощала течение паратифозной инфекции; в группе опытных мышей (зараженных микробами плюс фермент) количество павших было значительно большим, нежели в контрольной, а сроки гибели - более ранними.
Таким образом, при двух экспериментальных инфекциях с одинаковым типом течения (развитие сепсиса), но вызванных разными возбудителями, действие гиалуронидазы оказалось различным: гиалуронидаза практически не оказывала влияния на течение и исход стрептококковой инфекции и резко отягощала паратифозную. Естественно было полагать, что эти различия в действии гиалуронидазы зависели от разного ее влияния на тот и другой микробный агент.
По-видимому, гиалуронидаза оказывает на стрептококковую инфекцию "двойное действие": с одной стороны, способствует продвижению микробов из местного очага через соединительнотканные барьеры организма (как и при паратифозной инфекции), с другой - повреждает защитную капсулу и этим облегчает фагоцитоз микробов, что приводит к временному торможению инфекционного процесса на ранних его этапах. Таким образом, в организме зараженных стрептококком мышей гиалуронидаза имеет две разные точки приложения: межуточное вещество соединительной ткани хозяина и гиалуроновую кислоту капсульного вещества паразита. Обе стороны действия гиалуронидазы взаимно противоположны по своей биологической направленности, а поэтому стрептококковый инфекционный процесс, протекающий в присутствии фермента, является, по-видимому, их равнодействующей. Обе стороны в значительной степени уравновешивают друг друга, в силу чего течение и исход стрептококковой инфекции у "гиалуронидазных" мышей практически не отличались от наблюдавшихся в контрольных группах. Следует полагать, что указанное "двойное" действие гиалуронидазы имеет место не только в искусственных условиях эксперимента, во всяком случае в той мере, в какой речь идет о внеклеточном ферменте, который может воздействовать как на ткани организма, так и на составные части микробной клетки.
Полученные данные побудили нас продолжить исследования в направлении изучения роли иных факторов в патогенезе острой стрептококковой инфекции, в частности роли продуктов микробного распада.