Дезинтеграция микробов в организме в течение экспериментальной стрептококковой инфекции
Определение суммы микробного антигена в организме зараженных животных. В отношении инфекций, обусловленных микробами, не продуцирующими экзотоксинов, заслуживает серьезного внимания изучение возможной патогенетической роли продуктов микробного распада. Это относится в значительной мере и к стрептококковой инфекции, поскольку роль экзотоксина (эритрогенного токсина) ограничена и является решающей лишь в отношении одной нозологической формы - скарлатины.
Экспериментальное изучение указанного вопроса требовало выяснить динамику дезинтеграции микробов в течение инфекционного процесса.
Исходя из поставленной задачи, исследования проводились комбинированным методом: посредством количественного микробиологического исследования определяли процесс размножения микробов в организме; одновременно учитывали микробную дезинтеграцию при помощи серологического метода. С этой целью были использованы два приема: определение общего количества антигенных продуктов микробного распада в организме ("сумма микробного антигена") по поглощению вводимых антител и изучение динамики выведения стрептококкового антигена с мочой у зараженных животных. Опыты проводили на белых мышах. Для заражения применяли культуру гемолитического стрептококка I серологического типа, вирулентность которой поддерживалась постоянными пассажами на белых мышах (смертельная доза была в пределах 15-20 клеток). Мышей заражали непосредственно взвесью из селезенки мыши очередного пассажа, погибшей от стрептококкового сепсиса. Взвесь готовили на нормальной лошадиной сыворотке в разведении 1 : 200, во избежание отмирания микробов. Смотря по условиям опыта, мышей заражали внутрибрюшинно или подкожно в область пахового лимфатического узла. Для выявления стрептококкового антигена в организме мышей применяли иммунные сыворотки, приготовленные путем длительной иммунизации кроликов той же (пассажной) стрептококковой культурой. Сыворотки вводили зараженным мышам внутривенно в различных дозах и в разные периоды инфекционного процесса. В установленные сроки (от нескольких минут до нескольких часов после введения иммунной сыворотки) мышей обескровливали небольшими группами и в смеси сывороток от каждой группы определяли содержание стрептококковых антител посредством реакции связывания комплемента (РСК) с полисахаридный стрептококковым антигеном, приготовленным из культуры, которой были заражены мыши. Опыты ставили с четырьмя дозами комплемента (от одной до двух с половиной) в условиях длительного холодного связывания. Одновременно мышиные сыворотки исследовались в реакции агглютинации. Полученные результаты сопоставляли с данными контрольных опытов, т. е. с содержанием антител в крови незараженных мышей, которым была введена иммунная сыворотка в тех же условиях (сроки, дозы), как и в опыте. Убыль антител в организме зараженных животных надлежало, очевидно, отнести за счет их связывания специфическим антигеном.
Одновременно со взятием крови проводили количественные высевы из органов зараженных животных: при внутрибрюшинном заражении высевали обычно взвесь из селезенки и эксудат (смыв брюшной полости); при подкожном - взвеси из селезенки и регионарного лимфатического узла с окружающей его подкожной клетчаткой, т. е. местный очаг. Для посева применяли смеси экссудатов или органов от нескольких мышей одной группы. Органы предварительно растирали в ступке с мерным количеством физиологического раствора (1,0 мл на материал от одной мыши), а затем готовили ряд разведений с коэффициентом 10 (на разведенной лошадиной сыворотке, как указывалось выше); 0,05 мл каждого разведения наносили на чашку с кровяным агаром.
Связывание введенных антител специфическим антигеном осуществлялось в организме подопытных мышей быстрыми темпами: в пробах крови, взятых почти сразу после введения иммунной сыворотки и через полчаса, титр специфических антител уже был ниже не менее чем в 4 раза по сравнению с их содержанием в крови мышей контрольной группы; через 2 ч введенные антитела уже не определялись вовсе (при разведении исследуемых мышиных сывороток 1 : 10). Близкие к этому результаты были получены и в реакции агглютинации, что свидетельствовало об участии в поглощении антител как лизированных, так и корпускулярных стрептококковых антигенов (цельных клеток, живых и мертвых). При варьировании условий опыта, т. е. при заражении разными дозами вирулентных микробов и введении иммунной сыворотки в разные сроки после этого, можно было констатировать, что полнота поглощения антител зависела от степени наводнения организма животных микробами. Так, например, при внутрибрюшинном заражении большими дозами (1-2 млн. клеток) селезеночный показатель (микробный очаг в селезенке) достигал максимума через 4 ч и в соответствии наиболее полное поглощение антител отмечалось, если иммунную сыворотку вводили в указанный срок. При заражении малыми дозами (десятки клеток) полное связывание антител достигалось при введении иммунной сыворотки через 15-23 ч. В истощении вводимой иммунной сыворотки принимали участие, по-видимому, не только цельные микробные клетки, но и антигенные продукты их распада. Этот вывод вытекал из сопоставлений данных о фактическом и ожидаемом поглощении антител в организме зараженных животных. Последнее было определено по результатам следующих опытов.
Здоровым мышам была введена стрептококковая иммунная сыворотка в количестве 0,025 мл; через 2 ч после этого животные были обескровлены; смесь из полученных сывороток была поделена на ряд порций, каждую из которых в течение 2 ч в термостате подвергали контакту со стрептококковой культурой в дозе от 1,6 млрд. до 1,6 млн. (микробных тел), после чего их оставляли до утра в рефрижераторе. Затем сыворотки отделяли посредством центрифугирования от микробной взвеси, разводили дистиллированной водой в отношении 1 : 10, пропускали ток углекислоты из прибора Киппа для осаждения остатков микробного антигена, к прозрачной надосадочной жидкости добавляли по расчету хлористый натрий до концентрации 0,85% и ставили реакцию связывания комплемента с полисахаридный стрептококковым антигеном. Оказалось, что для полного истощения in vitro антител, имевшихся в мышиных сыворотках, требовалось примерно 160 млн. микробов; меньшее количество (16 млн. клеток) лишь незначительно снижало интенсивность серологической реакции.
Эти данные позволяли рассчитать примерную величину ожидаемого поглощения антител в организме мышей, зараженных разными дозами микробов с учетом сроков введения иммунной сыворотки и ее концентрации. Оказалось, что из 12 опытов не было случая, чтобы фактическое поглощение введенных антител было меньше ожидаемого и, напротив, более чем в половине исследований (7 из 12) оно было большим. Это давало основание считать, что в истощении иммунной сыворотки in vivo принимали участие, наряду с цельными клетками, и антигенные продукты микробного распада.
Можно к этому добавить сравнительные данные о поглощении антител в организме животных, зараженных внутрибрюшинно разными дозами микробов и обследованных в разные сроки.
При примерно одинаковом числе жизнеспособных микробов в брюшной полости и в селезенке поглощение антител осуществлялось с большей интенсивностью в тех случаях, когда мышей заражали малыми дозами (десятки клеток) и обследовали в поздние сроки (15-23 ч), чем при заражении большими дозами (миллионы) и обследовании в ранние периоды инфекционного процесса. Эти различия могли зависеть главным образом от накопления в организме мышей, зараженных малыми дозами, антигенных продуктов микробного распада, которые принимали, наряду с цельными клетками, участие в поглощении антител.
Таким образом, проведенные опыты указывали, что примененный метод позволял оценивать по степени поглощения антител из вводимой иммунной сыворотки общую сумму стрептококкового антигена в организме зараженных животных за счет цельных клеток (живых и мертвых) и продуктов их распада, еще сохранивших свою антигенную характеристику. Вместе с тем на основании типа поглощаемых антител (агглютинины, комплементсвязывающие антитела) не удавалось дифференцировать удельное значение корпускулярных и лизированных антигенов. Это побуждало продолжить поиски метода определения лизированной фракции антигена, являющейся продуктом микробного распада и непосредственно отображающей динамику этого процесса. Наиболее перспективным в этом отношении представлялось определение стрептококкового антигена в моче, поскольку почечный барьер, пропускающий растворенные продукты микробного распада, гарантировал лишь минимальное поступление в мочу корпускулярных антигенов.
Содержание стрептококкового антигена в моче зараженных животных в течение инфекционного процесса. Заражение мышей в этой серии опытов производилось, как и в прежних, разными дозами вирулентной культуры (в виде взвеси селезенки от мыши очередного пассажа), которую вводили в одних опытах внутрибрюшинно, в других подкожно, в паховую область. В разные сроки после заражения забирали для исследования мочу и кровь; мышей вскрывали группами и производили количественное микробиологическое исследование. Мочу и сыворотки крови от мышей каждой группы исследовали на содержание в них стрептококкового антигена посредством реакции связывания комплемента, для чего использовали противострептококковую иммунную сыворотку, полученную от кроликов, иммунизированных той же культурой, которую применяли для заражения.
Ввиду антикомплементарных свойств мочи ее подвергали предварительно суточному диализу против водопроводной воды при температуре 4°. Для этого мочу разводили дистиллированной водой в 5 раз (при малом количестве - в 10-20 раз) и помещали в целлофановые мешочки, погруженные в банку с водой. После окончания диализа мочу нормализовали (до 0,85% концентрации) раствором поваренной соли. Результаты серологических исследований сопоставляли с данными количественных высевов, как это приведено ниже.
При введении мышам больших доз микробов (2-3 млн.) стрептококковый антиген можно обнаружить в значительной концентрации уже через 5-8 ч после заражения; в более ранние сроки он не выявлялся. При заражении 800-1500 микробами стрептококковый антиген появлялся в моче и отчетливо обнаруживался лишь через 12 ч (при разведении мочи 1 : 5 полная задержка гемолиза происходила с 2,5 дозами комплемента, при разведении 1 : 10 с 1,5 дозы). Концентрация микробного антигена в моче быстро нарастала и достигала максимума к 18-22 ч после заражения. На сроке 23-24 ч кривая антигена оставалась еще на высоком уровне, хотя, как это было выявлено в опытах раститровки, имелась определенная тенденция к ее снижению; в дальнейшем большей частью наступала массовая гибель мышей.
Резко положительные реакции отмечались и в опытах заражения малыми дозами, если мочу исследовали на высоте инфекционного процесса. Стрептококковый антиген удавалось обнаружить и при разведении исследуемой мочи 1 : 20 и 1 : 40, хотя реакции и были менее выражены. Следовало признать, что растворенный антиген поступал в мочу в сравнительно значительной концентрации.
Аналогичные исследования были проведены при подкожном заражении мышей в паховую область. При заражении мышей малыми и средними дозами микробов (от 75 клеток до 3000) микробный антиген появлялся в моче, начиная с 16-20 ч после заражения. К 22-24 ч концентрация антигена нарастала и держалась на высоком уровне до 45-46 ч, т. е. до конца срока наблюдения, когда животные погибали. Повышение антигенных кривых не сопровождалось увеличением местных микробных очагов; в последних с 16-20 ч после заражения устанавливалось динамическое равновесие, независимо от введенной мышам дозы. Как уже указывалось, одинаковые (или близкие) микробные показатели в местных очагах свидетельствуют о наступившем балансе в процессах размножения и отмирания микробов. Появление в моче стрептококкового антигена и нарастание его концентрации отражало процесс микробного распада.
Следует отметить, что положительные результаты отмечались и при исследовании более разведенной мочи - 1 : 20 и 1 : 40, причем это не зависело от примененной для заражения дозы, что, по-видимому, объясняется отсутствием существенных различий в величине местных микробных очагов у мышей разных групп, о чем уже говорилось выше.
Вместе с тем при исследовании крови на предмет обнаружения стрептококкового антигена были получены нечеткие, слабоположительные или сомнительные реакции, указывавшие лишь на следы антигена - реакции на ±, +, + (++). Возможно, что при подкожном заражении менялся характер поступления антигена из местного очага в кровь (поступление малыми порциями) или элиминация его осуществлялась еще более интенсивно, чем в опытах, в которых производили внутрибрюшинное заражение. Таким образом, проведенные опыты показали возможность обнаружения стрептококкового антигена в моче зараженных мышей и использования этого показателя для суждения о процессе микробного распада в организме. Особенно демонстративными в этом отношении являются опыты, в которых имело место подкожное заражение и отмечался высокий уровень антигенной кривой в моче на фоне длительного динамического равновесия местных очагов.
Выявление микробного распада при экспериментальной стрептококковой инфекции в условиях лечения пенициллином. Возможность использовать кривую лизированного стрептококкового антигена для характеристики процесса микробного распада в организме в различные периоды экспериментальной стрептококковой инфекции поставила вопрос об изучении динамики соответствующих антигенных кривых в условиях усиленной и быстрой дезинтеграции микробов. Можно было ожидать, что такие условия усиленного микробного распада создаются в инфицированном организме при воздействии антибиотиков. Поэтому были поставлены опыты, в которых мышам, зараженным стрептококками, в установленные сроки вводили пенициллин и прослеживали динамику стрептококкового антигена в моче и в сыворотке крови. Эти наблюдения сочетались с количественными микробиологическими обследованиями. Как и в прежних опытах, для заражения использовали вирулентную культуру (в виде взвеси из селезенки от мыши очередного пассажа), которую вводили в одних опытах внутрибрюшинно, в других подкожно. Методика бактериологического и серологического исследований была той же, что и в прежних опытах. Полученные данные сопоставлялись с результатами контрольных опытов, в которых не проводилось лечение зараженных мышей пенициллином. Внутрибрюшинное заражение производилось двумя дозами стрептококков: большой (2-3 млн. микробов) и малой (150-175 микробов). В первом случае пенициллин вводили в ранние сроки (через 2-3 ч) после заражения; а при заражении малыми дозами лечение осуществлялось сравнительно поздно - через 18-20 ч после заражения, т. е. на высоте инфекционного процесса. Во всех случаях доза пенициллина была одинаковой - 1000 ЕД, вводимых однократно в объеме 0,5 мл подкожно, в область спины.
Введение пенициллина через короткий срок после заражения большой дозой приводило к резкому снижению микробного очага в брюшной полости, тогда как в группе контрольных животных очаг продолжал нарастать. В соответствии с этим антигенные кривые в моче у мышей разных групп претерпевали различную (и притом диаметрально противоположную) динамику. У подопытных мышей антиген в моче появлялся в высоких концентрациях уже через 15 мин - 1 ч после введения антибиотика, по-видимому, в результате массового разрушения микробов и высвобождения антигенных субстанций. Через 2 ч антигенная кривая заметно снижалась, а еще позже (через 7-8 ч после введения пенициллина) антиген не удавалось обнаружить в моче даже в условиях ее минимального разведения (1 : 5). Судя по характеру кривой, процесс разрушения микробов и выведения продуктов распада из организма осуществлялся в сравнительно быстром темпе. Возможно, что эта "стремительность" была причиной того, что в крови у мышей этой группы не удалось обнаружить микробный антиген в сколько-нибудь значительной концентрации ни на одном из этапов наблюдения. Обратные отношения отмечались в группе мышей, не получивших пенициллина. У них подъемы антигенных кривых в моче, а также в сыворотках крови отмечались в поздние сроки обследования (через 5-9 ч после заражения), т. е. в сроки, когда антиген в моче у опытных мышей был на спаде или его уровень находился ниже порога чувствительности серологической реакции. Вместе с тем максимальная концентрация антигена в моче у мышей контрольной группы была заметно ниже таковой у подопытных мышей.
Вытитровывание количества микробного антигена в моче мышей подопытной группы было проведено лишь на сроке 2 ч после лечения и показало, что он встречался в большем, чем 1 : 320 разведении. Стационарный характер антигенной кривой (отсутствие спада в поздний срок) связан, по-видимому, с нарастанием вторичных очагов во внутренних органах. Это в известной мере подтверждалось, и характером кривой антигена в крови: подъем через 2 ч, затем - выраженный спад и тенденция к новому подъему на последнем сроке обследования.
Суммируя данные опытов, в которых производилось лечение пенициллином и которые ставились в разных условиях (методы и дозы заражения, сроки введения антибиотика), можно прийти к следующему заключению: введение пенициллина всегда приводило к быстрому и резкому нарастанию стрептококкового антигена в моче зараженных мышей. При раннем применении пенициллина антиген сравнительно быстро выводился из организма (спад антигенных кривых). При поздно начатом лечений антигенные кривые длительное время оставались на высоком уровне; при этом концентрация антигена в моче была особо значительной, он определялся даже при исследовании мочи, разведенной 1 : 1000-1 : 5000 и более. Содержание стрептококкового антигена в сыворотке было ниже, чем в моче; однако при позднем применении пенициллина антиген в крови можно было обнаружить в значительной концентрации, т. е. при разведении исследуемых сывороток 1 : 80-1 : 320. Стрептококковый антиген, обнаруживаемый в моче и в сыворотке, являлся продуктом микробного распада и характеризовал собою процесс массового разрушения микробов, обусловленный действием антибиотика. Таким образом, примененный нами искусственный прием для повышения процесса микробного распада в опыте in vivo оказался весьма эффективным, так как с его помощью удалось получить ускоренное и увеличенное отображение процесса естественной дезинтеграции микробов, происходящей в инфицированном организме (отображение "крупным планом"); он позволил также на основе наглядных и четких данных судить о необычном в смысле темпа и выраженности наводнении организма микробными антигенами, наступающем под влиянием антибиотикотерапии. Следует также отметить, что способ определения микробного распада in vivo может найти применение, наряду с количественным микробиологическим исследованием, для реальной оценки эффективности антибиотиков различного спектра действия.
О динамике выведения из кровотока антигенных продуктов микробного распада. В описанных выше опытах было показано, что стрептококковый антиген, поступающий из местного очага в кровь, сравнительно быстро выводится оттуда и с большим постоянством может быть обнаружен в моче. Представлялось желательным изучить этот вопрос более подробно, поскольку он имеет непосредственное значение как для понимания патогенеза стрептококковой инфекции, так и для ее иммунологического анализа. В этом отношении наиболее перспективной представлялась такая постановка опыта, при которой антиген поступает в кровь в большом количестве, что облегчает его обнаружение серологическим методом.
В соответствии с этим мышей заражали внутрибрюшинно большими дозами микробов (3-5 млн. микробов), а через 2 ч мышам подкожно вводили пенициллин (однократно, в дозе от 10 до 10 000 ЕД). Затем мышей делили на две группы: одной из них вводили стрептококковую иммунсыворотку через 10- 15 мин, а другой - через 2 ч после введения пенициллина. Сыворотку вводили внутривенно в количестве 0,05 мл (в объеме 0,5 мл). Через 45 мин - 1 ч после введения иммунсыворотки мышей обескровливали и их сыворотки исследовали на содержание противострептококковых антител в реакции связывания комплемента с антигеном, изготовленным из той же культуры, которой производилось заражение. В этих опытах имелись три контрольные группы животных: а) мыши, зараженные одновременно с подопытными, но не получавшие пенициллина; иммунную сыворотку им вводили в те же сроки, что и подопытным мышам (так называемая I контрольная группа); б) незараженные мыши, получившие положенную дозу пенициллина и иммунную сыворотку (II контрольная группа); в) здоровые мыши, получившие только иммунсыворотку в установленной дозе (III контрольная группа).
Принципиально однозначные результаты были получены и в опытах с применением больших доз пенициллина (1000 и 10 000 ЕД). В последнем опыте у мышей, леченных пенициллином, микробные очаги оказались минимальными и в посевах экссудата из брюшной полости и селезенки были обнаружены лишь единичные микробы. Тем не менее, поглощение введенных антител в организме мышей первой опытной группы (получивших иммунную сыворотку через 15 мин после лечения и обследованных спустя 1 ч после этого) было весьма значительным и содержание антител в их сыворотках было в 8 раз ниже по сравнению с контрольными, незараженными животными, которым ввели одновременно ту же дозу иммунной сыворотки. У мышей второй опытной группы, которым иммунсыворотку ввели через 2 ч после пенициллина, титры антител в сыворотках отставали от контрольных показателей лишь в 2 раза.
Полученные данные указывали, что поглощение введенных антител, отмечавшееся у леченых мышей (в особенности у мышей I опытной группы, которым антитела были введены через 15 мин после введения пенициллина), происходило главным образом за счет их связывания антигенными продуктами микробного распада, а не за счет остаточных микробных очагов. Последние были очень невелики (в абсолютных показателях 8000-240 000 микробов для экссудата, 2000-18 000 для селезенки). Напомним, что, по ранее приведенным данным, для полного истощения антител из иммунной сыворотки, введенной мышам в разведении 1 : 20, требовалось примерно 160 млн. микробов. Вместе с тем из полученных результатов следовало, что антигенные продукты микробного распада, по-видимому, сравнительно быстро выводились из кровяного русла, так как содержание антител в крови мышей II опытной группы, которым иммунная сыворотка была введена через 2 ч после введения пенициллина, было заметно выше, чем у животных I опытной группы, и лишь в 2 раза ниже, чем у незараженных мышей, получивших иммунную сыворотку (III контрольная группа).
В целях более детального изучения скорости элиминации продуктов микробного распада из организма был поставлен дополнительный опыт. Мышам четырех групп, зараженным стрептококком и леченным пенициллином, вводили иммунную сыворотку через короткие интервалы времени: через 10 мин, 30 мин и 2 ч 40 мин после введения пенициллина. Пятую группу (контрольную) составили здоровые мыши, получившие одновременно с мышами I группы ту же дозу иммунной сыворотки. Остаточные микробные очаги были у всех мышей либо невелики, либо вовсе ничтожны, что исключало сколько-нибудь серьезное их влияние на процесс поглощения введенных антител. Вместе с тем можно констатировать, что с удлинением срока между инъекцией пенициллина и введением иммунной сыворотки отчетливо нарастало содержание свободных антител в сыворотках мышей; в максимальной концентрации они имелись в сыворотке мышей IV группы. Путем сравнения интенсивности серологических реакций в опытных и контрольных группах можно было определить примерные коэффициенты поглощения для каждой из четырех групп мышей: для I показатель был близок 8, для II - 4, для III - 2. У мышей IV группы, получивших иммунную сыворотку почти через 3 ч после введения антибиотика, количество свободных антител соответствовало их содержанию в сыворотках мышей контрольной группы; это указывало, что к данному сроку антигенные продукты микробного разрушения были полностью элиминированы из кровяного русла.
Для изложенных опытов были избраны условия наиболее удобные в отношении выявления "суммы антигена" в организме путем поглощения вводимых антител (заражение внутрибрюшинно большой дозой микробов и введение пенициллина через 2 ч). Вполне понятно, однако, что полученные результаты имеют общее значение для ответа на вопрос о сроках выведения из кровяного русла антигенных продуктов распада стрептококков, независимо от условий заражения. Последние определяют различную динамику размножения микробов и их дезинтеграции, но не могут влиять на процесс элиминации из крови продуктов микробного распада. И если при подкожном заражении и при запоздалом введении пенициллина стрептококковый антиген продолжал обнаруживаться в моче в течение длительного времени, то это указывало на продолжающееся поступление его в кровь, а следовательно, на наличие очагов, в которых происходит микробный распад. Понятно, что это может поддерживаться длительное время лишь в том случае, если распад компенсируется размножением микробов. А это в свою очередь определяет клиническое значение исследований мочи на присутствие стрептококкового антигена в условиях лечения пенициллином.
Экспериментальное изучение указанного вопроса требовало выяснить динамику дезинтеграции микробов в течение инфекционного процесса.
Исходя из поставленной задачи, исследования проводились комбинированным методом: посредством количественного микробиологического исследования определяли процесс размножения микробов в организме; одновременно учитывали микробную дезинтеграцию при помощи серологического метода. С этой целью были использованы два приема: определение общего количества антигенных продуктов микробного распада в организме ("сумма микробного антигена") по поглощению вводимых антител и изучение динамики выведения стрептококкового антигена с мочой у зараженных животных. Опыты проводили на белых мышах. Для заражения применяли культуру гемолитического стрептококка I серологического типа, вирулентность которой поддерживалась постоянными пассажами на белых мышах (смертельная доза была в пределах 15-20 клеток). Мышей заражали непосредственно взвесью из селезенки мыши очередного пассажа, погибшей от стрептококкового сепсиса. Взвесь готовили на нормальной лошадиной сыворотке в разведении 1 : 200, во избежание отмирания микробов. Смотря по условиям опыта, мышей заражали внутрибрюшинно или подкожно в область пахового лимфатического узла. Для выявления стрептококкового антигена в организме мышей применяли иммунные сыворотки, приготовленные путем длительной иммунизации кроликов той же (пассажной) стрептококковой культурой. Сыворотки вводили зараженным мышам внутривенно в различных дозах и в разные периоды инфекционного процесса. В установленные сроки (от нескольких минут до нескольких часов после введения иммунной сыворотки) мышей обескровливали небольшими группами и в смеси сывороток от каждой группы определяли содержание стрептококковых антител посредством реакции связывания комплемента (РСК) с полисахаридный стрептококковым антигеном, приготовленным из культуры, которой были заражены мыши. Опыты ставили с четырьмя дозами комплемента (от одной до двух с половиной) в условиях длительного холодного связывания. Одновременно мышиные сыворотки исследовались в реакции агглютинации. Полученные результаты сопоставляли с данными контрольных опытов, т. е. с содержанием антител в крови незараженных мышей, которым была введена иммунная сыворотка в тех же условиях (сроки, дозы), как и в опыте. Убыль антител в организме зараженных животных надлежало, очевидно, отнести за счет их связывания специфическим антигеном.
Одновременно со взятием крови проводили количественные высевы из органов зараженных животных: при внутрибрюшинном заражении высевали обычно взвесь из селезенки и эксудат (смыв брюшной полости); при подкожном - взвеси из селезенки и регионарного лимфатического узла с окружающей его подкожной клетчаткой, т. е. местный очаг. Для посева применяли смеси экссудатов или органов от нескольких мышей одной группы. Органы предварительно растирали в ступке с мерным количеством физиологического раствора (1,0 мл на материал от одной мыши), а затем готовили ряд разведений с коэффициентом 10 (на разведенной лошадиной сыворотке, как указывалось выше); 0,05 мл каждого разведения наносили на чашку с кровяным агаром.
Связывание введенных антител специфическим антигеном осуществлялось в организме подопытных мышей быстрыми темпами: в пробах крови, взятых почти сразу после введения иммунной сыворотки и через полчаса, титр специфических антител уже был ниже не менее чем в 4 раза по сравнению с их содержанием в крови мышей контрольной группы; через 2 ч введенные антитела уже не определялись вовсе (при разведении исследуемых мышиных сывороток 1 : 10). Близкие к этому результаты были получены и в реакции агглютинации, что свидетельствовало об участии в поглощении антител как лизированных, так и корпускулярных стрептококковых антигенов (цельных клеток, живых и мертвых). При варьировании условий опыта, т. е. при заражении разными дозами вирулентных микробов и введении иммунной сыворотки в разные сроки после этого, можно было констатировать, что полнота поглощения антител зависела от степени наводнения организма животных микробами. Так, например, при внутрибрюшинном заражении большими дозами (1-2 млн. клеток) селезеночный показатель (микробный очаг в селезенке) достигал максимума через 4 ч и в соответствии наиболее полное поглощение антител отмечалось, если иммунную сыворотку вводили в указанный срок. При заражении малыми дозами (десятки клеток) полное связывание антител достигалось при введении иммунной сыворотки через 15-23 ч. В истощении вводимой иммунной сыворотки принимали участие, по-видимому, не только цельные микробные клетки, но и антигенные продукты их распада. Этот вывод вытекал из сопоставлений данных о фактическом и ожидаемом поглощении антител в организме зараженных животных. Последнее было определено по результатам следующих опытов.
Здоровым мышам была введена стрептококковая иммунная сыворотка в количестве 0,025 мл; через 2 ч после этого животные были обескровлены; смесь из полученных сывороток была поделена на ряд порций, каждую из которых в течение 2 ч в термостате подвергали контакту со стрептококковой культурой в дозе от 1,6 млрд. до 1,6 млн. (микробных тел), после чего их оставляли до утра в рефрижераторе. Затем сыворотки отделяли посредством центрифугирования от микробной взвеси, разводили дистиллированной водой в отношении 1 : 10, пропускали ток углекислоты из прибора Киппа для осаждения остатков микробного антигена, к прозрачной надосадочной жидкости добавляли по расчету хлористый натрий до концентрации 0,85% и ставили реакцию связывания комплемента с полисахаридный стрептококковым антигеном. Оказалось, что для полного истощения in vitro антител, имевшихся в мышиных сыворотках, требовалось примерно 160 млн. микробов; меньшее количество (16 млн. клеток) лишь незначительно снижало интенсивность серологической реакции.
Эти данные позволяли рассчитать примерную величину ожидаемого поглощения антител в организме мышей, зараженных разными дозами микробов с учетом сроков введения иммунной сыворотки и ее концентрации. Оказалось, что из 12 опытов не было случая, чтобы фактическое поглощение введенных антител было меньше ожидаемого и, напротив, более чем в половине исследований (7 из 12) оно было большим. Это давало основание считать, что в истощении иммунной сыворотки in vivo принимали участие, наряду с цельными клетками, и антигенные продукты микробного распада.
Можно к этому добавить сравнительные данные о поглощении антител в организме животных, зараженных внутрибрюшинно разными дозами микробов и обследованных в разные сроки.
При примерно одинаковом числе жизнеспособных микробов в брюшной полости и в селезенке поглощение антител осуществлялось с большей интенсивностью в тех случаях, когда мышей заражали малыми дозами (десятки клеток) и обследовали в поздние сроки (15-23 ч), чем при заражении большими дозами (миллионы) и обследовании в ранние периоды инфекционного процесса. Эти различия могли зависеть главным образом от накопления в организме мышей, зараженных малыми дозами, антигенных продуктов микробного распада, которые принимали, наряду с цельными клетками, участие в поглощении антител.
Таким образом, проведенные опыты указывали, что примененный метод позволял оценивать по степени поглощения антител из вводимой иммунной сыворотки общую сумму стрептококкового антигена в организме зараженных животных за счет цельных клеток (живых и мертвых) и продуктов их распада, еще сохранивших свою антигенную характеристику. Вместе с тем на основании типа поглощаемых антител (агглютинины, комплементсвязывающие антитела) не удавалось дифференцировать удельное значение корпускулярных и лизированных антигенов. Это побуждало продолжить поиски метода определения лизированной фракции антигена, являющейся продуктом микробного распада и непосредственно отображающей динамику этого процесса. Наиболее перспективным в этом отношении представлялось определение стрептококкового антигена в моче, поскольку почечный барьер, пропускающий растворенные продукты микробного распада, гарантировал лишь минимальное поступление в мочу корпускулярных антигенов.
Содержание стрептококкового антигена в моче зараженных животных в течение инфекционного процесса. Заражение мышей в этой серии опытов производилось, как и в прежних, разными дозами вирулентной культуры (в виде взвеси селезенки от мыши очередного пассажа), которую вводили в одних опытах внутрибрюшинно, в других подкожно, в паховую область. В разные сроки после заражения забирали для исследования мочу и кровь; мышей вскрывали группами и производили количественное микробиологическое исследование. Мочу и сыворотки крови от мышей каждой группы исследовали на содержание в них стрептококкового антигена посредством реакции связывания комплемента, для чего использовали противострептококковую иммунную сыворотку, полученную от кроликов, иммунизированных той же культурой, которую применяли для заражения.
Ввиду антикомплементарных свойств мочи ее подвергали предварительно суточному диализу против водопроводной воды при температуре 4°. Для этого мочу разводили дистиллированной водой в 5 раз (при малом количестве - в 10-20 раз) и помещали в целлофановые мешочки, погруженные в банку с водой. После окончания диализа мочу нормализовали (до 0,85% концентрации) раствором поваренной соли. Результаты серологических исследований сопоставляли с данными количественных высевов, как это приведено ниже.
При введении мышам больших доз микробов (2-3 млн.) стрептококковый антиген можно обнаружить в значительной концентрации уже через 5-8 ч после заражения; в более ранние сроки он не выявлялся. При заражении 800-1500 микробами стрептококковый антиген появлялся в моче и отчетливо обнаруживался лишь через 12 ч (при разведении мочи 1 : 5 полная задержка гемолиза происходила с 2,5 дозами комплемента, при разведении 1 : 10 с 1,5 дозы). Концентрация микробного антигена в моче быстро нарастала и достигала максимума к 18-22 ч после заражения. На сроке 23-24 ч кривая антигена оставалась еще на высоком уровне, хотя, как это было выявлено в опытах раститровки, имелась определенная тенденция к ее снижению; в дальнейшем большей частью наступала массовая гибель мышей.
Резко положительные реакции отмечались и в опытах заражения малыми дозами, если мочу исследовали на высоте инфекционного процесса. Стрептококковый антиген удавалось обнаружить и при разведении исследуемой мочи 1 : 20 и 1 : 40, хотя реакции и были менее выражены. Следовало признать, что растворенный антиген поступал в мочу в сравнительно значительной концентрации.
Аналогичные исследования были проведены при подкожном заражении мышей в паховую область. При заражении мышей малыми и средними дозами микробов (от 75 клеток до 3000) микробный антиген появлялся в моче, начиная с 16-20 ч после заражения. К 22-24 ч концентрация антигена нарастала и держалась на высоком уровне до 45-46 ч, т. е. до конца срока наблюдения, когда животные погибали. Повышение антигенных кривых не сопровождалось увеличением местных микробных очагов; в последних с 16-20 ч после заражения устанавливалось динамическое равновесие, независимо от введенной мышам дозы. Как уже указывалось, одинаковые (или близкие) микробные показатели в местных очагах свидетельствуют о наступившем балансе в процессах размножения и отмирания микробов. Появление в моче стрептококкового антигена и нарастание его концентрации отражало процесс микробного распада.
Следует отметить, что положительные результаты отмечались и при исследовании более разведенной мочи - 1 : 20 и 1 : 40, причем это не зависело от примененной для заражения дозы, что, по-видимому, объясняется отсутствием существенных различий в величине местных микробных очагов у мышей разных групп, о чем уже говорилось выше.
Вместе с тем при исследовании крови на предмет обнаружения стрептококкового антигена были получены нечеткие, слабоположительные или сомнительные реакции, указывавшие лишь на следы антигена - реакции на ±, +, + (++). Возможно, что при подкожном заражении менялся характер поступления антигена из местного очага в кровь (поступление малыми порциями) или элиминация его осуществлялась еще более интенсивно, чем в опытах, в которых производили внутрибрюшинное заражение. Таким образом, проведенные опыты показали возможность обнаружения стрептококкового антигена в моче зараженных мышей и использования этого показателя для суждения о процессе микробного распада в организме. Особенно демонстративными в этом отношении являются опыты, в которых имело место подкожное заражение и отмечался высокий уровень антигенной кривой в моче на фоне длительного динамического равновесия местных очагов.
Выявление микробного распада при экспериментальной стрептококковой инфекции в условиях лечения пенициллином. Возможность использовать кривую лизированного стрептококкового антигена для характеристики процесса микробного распада в организме в различные периоды экспериментальной стрептококковой инфекции поставила вопрос об изучении динамики соответствующих антигенных кривых в условиях усиленной и быстрой дезинтеграции микробов. Можно было ожидать, что такие условия усиленного микробного распада создаются в инфицированном организме при воздействии антибиотиков. Поэтому были поставлены опыты, в которых мышам, зараженным стрептококками, в установленные сроки вводили пенициллин и прослеживали динамику стрептококкового антигена в моче и в сыворотке крови. Эти наблюдения сочетались с количественными микробиологическими обследованиями. Как и в прежних опытах, для заражения использовали вирулентную культуру (в виде взвеси из селезенки от мыши очередного пассажа), которую вводили в одних опытах внутрибрюшинно, в других подкожно. Методика бактериологического и серологического исследований была той же, что и в прежних опытах. Полученные данные сопоставлялись с результатами контрольных опытов, в которых не проводилось лечение зараженных мышей пенициллином. Внутрибрюшинное заражение производилось двумя дозами стрептококков: большой (2-3 млн. микробов) и малой (150-175 микробов). В первом случае пенициллин вводили в ранние сроки (через 2-3 ч) после заражения; а при заражении малыми дозами лечение осуществлялось сравнительно поздно - через 18-20 ч после заражения, т. е. на высоте инфекционного процесса. Во всех случаях доза пенициллина была одинаковой - 1000 ЕД, вводимых однократно в объеме 0,5 мл подкожно, в область спины.
Введение пенициллина через короткий срок после заражения большой дозой приводило к резкому снижению микробного очага в брюшной полости, тогда как в группе контрольных животных очаг продолжал нарастать. В соответствии с этим антигенные кривые в моче у мышей разных групп претерпевали различную (и притом диаметрально противоположную) динамику. У подопытных мышей антиген в моче появлялся в высоких концентрациях уже через 15 мин - 1 ч после введения антибиотика, по-видимому, в результате массового разрушения микробов и высвобождения антигенных субстанций. Через 2 ч антигенная кривая заметно снижалась, а еще позже (через 7-8 ч после введения пенициллина) антиген не удавалось обнаружить в моче даже в условиях ее минимального разведения (1 : 5). Судя по характеру кривой, процесс разрушения микробов и выведения продуктов распада из организма осуществлялся в сравнительно быстром темпе. Возможно, что эта "стремительность" была причиной того, что в крови у мышей этой группы не удалось обнаружить микробный антиген в сколько-нибудь значительной концентрации ни на одном из этапов наблюдения. Обратные отношения отмечались в группе мышей, не получивших пенициллина. У них подъемы антигенных кривых в моче, а также в сыворотках крови отмечались в поздние сроки обследования (через 5-9 ч после заражения), т. е. в сроки, когда антиген в моче у опытных мышей был на спаде или его уровень находился ниже порога чувствительности серологической реакции. Вместе с тем максимальная концентрация антигена в моче у мышей контрольной группы была заметно ниже таковой у подопытных мышей.
Вытитровывание количества микробного антигена в моче мышей подопытной группы было проведено лишь на сроке 2 ч после лечения и показало, что он встречался в большем, чем 1 : 320 разведении. Стационарный характер антигенной кривой (отсутствие спада в поздний срок) связан, по-видимому, с нарастанием вторичных очагов во внутренних органах. Это в известной мере подтверждалось, и характером кривой антигена в крови: подъем через 2 ч, затем - выраженный спад и тенденция к новому подъему на последнем сроке обследования.
Суммируя данные опытов, в которых производилось лечение пенициллином и которые ставились в разных условиях (методы и дозы заражения, сроки введения антибиотика), можно прийти к следующему заключению: введение пенициллина всегда приводило к быстрому и резкому нарастанию стрептококкового антигена в моче зараженных мышей. При раннем применении пенициллина антиген сравнительно быстро выводился из организма (спад антигенных кривых). При поздно начатом лечений антигенные кривые длительное время оставались на высоком уровне; при этом концентрация антигена в моче была особо значительной, он определялся даже при исследовании мочи, разведенной 1 : 1000-1 : 5000 и более. Содержание стрептококкового антигена в сыворотке было ниже, чем в моче; однако при позднем применении пенициллина антиген в крови можно было обнаружить в значительной концентрации, т. е. при разведении исследуемых сывороток 1 : 80-1 : 320. Стрептококковый антиген, обнаруживаемый в моче и в сыворотке, являлся продуктом микробного распада и характеризовал собою процесс массового разрушения микробов, обусловленный действием антибиотика. Таким образом, примененный нами искусственный прием для повышения процесса микробного распада в опыте in vivo оказался весьма эффективным, так как с его помощью удалось получить ускоренное и увеличенное отображение процесса естественной дезинтеграции микробов, происходящей в инфицированном организме (отображение "крупным планом"); он позволил также на основе наглядных и четких данных судить о необычном в смысле темпа и выраженности наводнении организма микробными антигенами, наступающем под влиянием антибиотикотерапии. Следует также отметить, что способ определения микробного распада in vivo может найти применение, наряду с количественным микробиологическим исследованием, для реальной оценки эффективности антибиотиков различного спектра действия.
О динамике выведения из кровотока антигенных продуктов микробного распада. В описанных выше опытах было показано, что стрептококковый антиген, поступающий из местного очага в кровь, сравнительно быстро выводится оттуда и с большим постоянством может быть обнаружен в моче. Представлялось желательным изучить этот вопрос более подробно, поскольку он имеет непосредственное значение как для понимания патогенеза стрептококковой инфекции, так и для ее иммунологического анализа. В этом отношении наиболее перспективной представлялась такая постановка опыта, при которой антиген поступает в кровь в большом количестве, что облегчает его обнаружение серологическим методом.
В соответствии с этим мышей заражали внутрибрюшинно большими дозами микробов (3-5 млн. микробов), а через 2 ч мышам подкожно вводили пенициллин (однократно, в дозе от 10 до 10 000 ЕД). Затем мышей делили на две группы: одной из них вводили стрептококковую иммунсыворотку через 10- 15 мин, а другой - через 2 ч после введения пенициллина. Сыворотку вводили внутривенно в количестве 0,05 мл (в объеме 0,5 мл). Через 45 мин - 1 ч после введения иммунсыворотки мышей обескровливали и их сыворотки исследовали на содержание противострептококковых антител в реакции связывания комплемента с антигеном, изготовленным из той же культуры, которой производилось заражение. В этих опытах имелись три контрольные группы животных: а) мыши, зараженные одновременно с подопытными, но не получавшие пенициллина; иммунную сыворотку им вводили в те же сроки, что и подопытным мышам (так называемая I контрольная группа); б) незараженные мыши, получившие положенную дозу пенициллина и иммунную сыворотку (II контрольная группа); в) здоровые мыши, получившие только иммунсыворотку в установленной дозе (III контрольная группа).
Принципиально однозначные результаты были получены и в опытах с применением больших доз пенициллина (1000 и 10 000 ЕД). В последнем опыте у мышей, леченных пенициллином, микробные очаги оказались минимальными и в посевах экссудата из брюшной полости и селезенки были обнаружены лишь единичные микробы. Тем не менее, поглощение введенных антител в организме мышей первой опытной группы (получивших иммунную сыворотку через 15 мин после лечения и обследованных спустя 1 ч после этого) было весьма значительным и содержание антител в их сыворотках было в 8 раз ниже по сравнению с контрольными, незараженными животными, которым ввели одновременно ту же дозу иммунной сыворотки. У мышей второй опытной группы, которым иммунсыворотку ввели через 2 ч после пенициллина, титры антител в сыворотках отставали от контрольных показателей лишь в 2 раза.
Полученные данные указывали, что поглощение введенных антител, отмечавшееся у леченых мышей (в особенности у мышей I опытной группы, которым антитела были введены через 15 мин после введения пенициллина), происходило главным образом за счет их связывания антигенными продуктами микробного распада, а не за счет остаточных микробных очагов. Последние были очень невелики (в абсолютных показателях 8000-240 000 микробов для экссудата, 2000-18 000 для селезенки). Напомним, что, по ранее приведенным данным, для полного истощения антител из иммунной сыворотки, введенной мышам в разведении 1 : 20, требовалось примерно 160 млн. микробов. Вместе с тем из полученных результатов следовало, что антигенные продукты микробного распада, по-видимому, сравнительно быстро выводились из кровяного русла, так как содержание антител в крови мышей II опытной группы, которым иммунная сыворотка была введена через 2 ч после введения пенициллина, было заметно выше, чем у животных I опытной группы, и лишь в 2 раза ниже, чем у незараженных мышей, получивших иммунную сыворотку (III контрольная группа).
В целях более детального изучения скорости элиминации продуктов микробного распада из организма был поставлен дополнительный опыт. Мышам четырех групп, зараженным стрептококком и леченным пенициллином, вводили иммунную сыворотку через короткие интервалы времени: через 10 мин, 30 мин и 2 ч 40 мин после введения пенициллина. Пятую группу (контрольную) составили здоровые мыши, получившие одновременно с мышами I группы ту же дозу иммунной сыворотки. Остаточные микробные очаги были у всех мышей либо невелики, либо вовсе ничтожны, что исключало сколько-нибудь серьезное их влияние на процесс поглощения введенных антител. Вместе с тем можно констатировать, что с удлинением срока между инъекцией пенициллина и введением иммунной сыворотки отчетливо нарастало содержание свободных антител в сыворотках мышей; в максимальной концентрации они имелись в сыворотке мышей IV группы. Путем сравнения интенсивности серологических реакций в опытных и контрольных группах можно было определить примерные коэффициенты поглощения для каждой из четырех групп мышей: для I показатель был близок 8, для II - 4, для III - 2. У мышей IV группы, получивших иммунную сыворотку почти через 3 ч после введения антибиотика, количество свободных антител соответствовало их содержанию в сыворотках мышей контрольной группы; это указывало, что к данному сроку антигенные продукты микробного разрушения были полностью элиминированы из кровяного русла.
Для изложенных опытов были избраны условия наиболее удобные в отношении выявления "суммы антигена" в организме путем поглощения вводимых антител (заражение внутрибрюшинно большой дозой микробов и введение пенициллина через 2 ч). Вполне понятно, однако, что полученные результаты имеют общее значение для ответа на вопрос о сроках выведения из кровяного русла антигенных продуктов распада стрептококков, независимо от условий заражения. Последние определяют различную динамику размножения микробов и их дезинтеграции, но не могут влиять на процесс элиминации из крови продуктов микробного распада. И если при подкожном заражении и при запоздалом введении пенициллина стрептококковый антиген продолжал обнаруживаться в моче в течение длительного времени, то это указывало на продолжающееся поступление его в кровь, а следовательно, на наличие очагов, в которых происходит микробный распад. Понятно, что это может поддерживаться длительное время лишь в том случае, если распад компенсируется размножением микробов. А это в свою очередь определяет клиническое значение исследований мочи на присутствие стрептококкового антигена в условиях лечения пенициллином.