Модель фокальной инкапсулированной стрептококковой инфекции
Моделирование в опытах на животных хронической стрептококковой инфекции является далеко не разрешенной задачей. В последнее время предложен метод внутрибрюшинного экспериментального заражения животных стрептококками, находящимися в диффузионной камере. В настоящей статье изучалась возможность создать инкапсулированный стрептококковый очаг.
Опыты производились на взрослых морских свинках и белых крысах. Животных заражали в одних случаях мало вирулентным лабораторным штаммом стрептококка 1-го типа группы А, в S-фазе и в других - вирулентной культурой того же штамма в R-фазе. Техника заражения заключалась в следующем: одну петлю суточной культуры стрептококка на 5%-ном кровяном агаре засевали в такую же среду растопленную и остуженную до 40°. Затем, после быстрого перемешивания, засеянный агар разливали в обернутые целлофаном тонкостенные ампулы, длина которых составляла 2,5-3 см, диаметр - 0,5-0,7 см. Стенки ампул и донышки были перфорированными. По застывании агара ампулы, освобожденные от целлофановой обертки, погружали в перитонеальную полость подопытного животного через небольшой разрез в брюшной стенке. Рану закрывали наглухо двухслойным швом. Ни в одном случае не было каких-либо осложнений, мешавших быстрому заживлению операционной раны. Животные, зараженные описанным способом, находились под наблюдением от нескольких дней до 16 месяцев. Всего было оперировано 29 морских свинок и 52 крысы.
Для бактериологического исследования из трупов павших или убитых в разные сроки животных извлекали ампулы с агаром, переносили их в стерильную ступку, измельчали и после добавления необходимого количества физиологического раствора засевали на кровяной агар в чашках. Отдельно исследовали также материал, снятый ватным тампоном с внутренней и наружной стороны соединительнотканной капсулы, окружавшей ампулу в брюшной полости. Делали также посевы селезенки, брыжеечных лимфатических узлов и крови из сердца. Определение антител производили посредством реакции агглютинации (на стекле); а также реакции связывания комплемента; в последнем случае пользовались полисахаридный антигеном из культуры, которая применялась для заражения, а сыворотки разводили от 1:2 до 1 : 160. Для внутрикожных аллергических проб использовали препараты стрептококкового полисахарида и нуклеопротеида.
Ниже приводятся результаты проведенных опытов.
Опыты с вирулентной культурой. При заражении вирулентным штаммом стрептококка все подопытные морские свинки погибали в течение недели, а крысы в течение первых двух недель, при явлениях генерализованной стрептококковой инфекции. У павших животных отмечался острый перитонит, множественные абсцессы в почках и печени, из которых были выделены стрептококки. Большое количество стрептококков было обнаружено у павших животных также во всех лимфатических узлах, селезенке и крови.
Опыты с авирулентной культурой. В этих опытах животные не погибали, а их вскрывали в разные сроки после заражения для бактериологического исследования. Первые морские свинки были вскрыты через 5 суток, а последние спустя 16 месяцев после заражения. Крыс вскрывали соответственно через 2 недели и 9 месяцев. Вскрытие животных показало, что внесенная ампула с посевом авирулентного стрептококка очень скоро фиксировалась в брюшной полости и при этом развивался локальный слипчивый перитонит. В этом процессе самую активную роль играл сальник, который обволакивал перфорированную ампулу, создавая вокруг нее соединительнотканную капсулу. Тонкая капсула в дальнейшем настолько уплотнялась, что это подчас затрудняло ее вылущивание, так как на внутренней стенке образовывались соединительнотканные сосочки, которые врастали в отверстия, имевшиеся в стенках ампул. Кровяной агар в ампулах с посевом стрептококка в брюшной полости подопытного животного в течение первых двух недель приобретал бурый цвет. На более поздних сроках благодаря гемолизу и разрушению гемоглобина агар вовсе терял окраску. Посевы крови и измельченных селезенок дали отрицательный результат у всех 25 обследованных морских свинок в сроки от 5 до 480 дней после заражения и у 50 крыс, вскрытых через 10-280 дней от начала опыта. Лишь у 2 морских свинок и у 1 крысы удалось выделить стрептококки из мезентериальных лимфатических узлов. В то же время у всех животных и на всех сроках были выделены гемолитические стрептококки из содержимого ампулы и из материала, снятого с внутренней стороны соединительнотканной капсулы; они оказались идентичными исходной культуре по серологическим свойствам.
Количественные исследования были проведены лишь в течение первой недели после погружения ампул в брюшную полость животных. Они показали, что на этом сроке число жизнеспособных стрептококков в агаре оставалось стабильным. Надо добавить, что в одном из опытов спустя 3 месяца после его начала ампулы с культурой стрептококка из брюшной полости 4 морских свинок были перенесены в брюшную полость 4 других свинок, которые находились под наблюдением 4 месяца. При вскрытии у них был найден такой же инкапсулированный очаг инфекции, как у животных, зараженных исходной культурой. Попытки выделить культуру микроба из мазков с наружной стороны капсулы остались во всех случаях безрезультатными.
Серологические исследования. Были исследованы сыворотки 18 морских свинок и такого же числа крыс, полученные через 3 недели, 1,5 месяца, 6 месяцев и 1 год после заражения животных. Сыворотки 6 морских свинок вовсе не агглютинировали стрептококков; сыворотки 7 животных могли агглютинировать исходную стрептококковую культуру лишь в неразведенном виде; у 5 животных агглютинационный титр сыворотки достигал 1 : 20. Такой же результат был получен при изучении крысиных сывороток: 6 сывороток дали отрицательный результат, 3 сыворотки вызывали агглютинацию лишь в неразведенном виде и 9 сывороток имели титр 1 : 4 или 1 : 8.
Исследование посредством реакции связывания комплемента сывороток, взятых у нескольких морских свинок в ранние сроки после заражения (до 45 дней), дало отрицательный результат. В крови подопытных животных не удавалось также обнаружить стрептококкового антигена.
Воспроизведение местной аллергической реакции. В разные сроки после заражения (от 1 недели до 1 года) проверяли реакцию подопытных животных на внутрикожное введение вакцины из исходной культуры, препарата группового полисахарида, полученного по методу Ланкефильду, и стрептококкового нуклеопротеида. Местные реакции у зараженных животных лишь незначительно отличались от реакций, отмеченных у контрольных морских свинок и крыс.
Ответная реакция на подкожное введение стрептококкового антигена. Спустя год после введения ампулы с культурой авирулентного стрептококка 3 морским свинкам была однократно введена гретая стрептококковая вакцина в дозе, которая не вызвала продукции агглютининов у трех контрольных морских свинок. В то же время у подопытных животных титры сыворотки повысились через 10 дней после вакцинации: у 2 свинок с 1 : 20 до 1 : 40 и 1 : 80, а у третьей с 1 : 1 до 1 : 20.
Опыты повторного заражения. Десять крыс, зараженных культурой авирулентного стрептококка в ампуле, спустя полтора месяца вновь были подвергнуты операции. Половине животных в брюшную полость была внесена вторая ампула со свежим посевом исходного штамма авирулентного стрептококка. Другой половине крыс в брюшную полость внесли ампулы с посевом вирулентной культуры того же штамма стрептококка, что вызвало гибель всех животных от острой генерализованной стрептококковой инфекции в течение суток. В то же время следствием повторного внесения ампулы с посевом авирулентного стрептококка было развитие второго инкапсулированного очага стрептококковой инфекции с таким же затяжным течением, как и при первом заражении.
Опыты искусственного обострения процесса. В двух опытах на крысах была сделана попытка спровоцировать обострение инфекции. В одном из них зараженные животные были разделены спустя 2 недели на 2 группы, одну из которых подвергали охлаждению, поместив клетку на 2 дня в хладокамеру при температуре 2-3° под струю воздуха от вентилятора. Животных вскрывали и обследовали через 2 и 7 дней после охлаждения; одновременно исследовали и животных второй группы. В обеих группах стрептококки были выделены только из ампул и из материала, снятого с внутренней стороны капсулы.
В другом опыте крыс подвергали тотальному облучению разными дозами рентгеновых лучей спустя 1-2 недели после их заражения описанным методом. Из 25 животных, облученных 300-400 р, пали 5, и у 2 из них были высеяны из крови гемолитические стрептококки. При облучении 500-700 р пали 15 крыс, и у 9 из них посевы крови дали положительный результат. Следует, однако, отметить, что все 11 гемокультур стрептококка были получены при посеве крови, взятой в предагональной или атональной стадиях. В сыворотках крови, взятых в более ранние сроки после облучения, стрептококки не были обнаружены. Не удалось также выделить стрептококков из крови, лимфатических узлов и внутренних органов ни у одной крысы, выжившей после облучения. В этих случаях культуры микроба были получены только в посевах материала с внутренней стороны соединительнотканной капсулы и из ампулы с агаром, находившейся в брюшной полости облученных животных. Примененная в работе методика позволяла воспроизвести хронический инкапсулированный инфекционный очаг при использовании слабовирулентного штамма гемолитического стрептококка.
Образующаяся вокруг вводимого инородного тела (ампулы) плотная соединительнотканная капсула препятствует распространению стрептококков и генерализации инфекции. Нельзя, конечно, исключить прохождения немногих микробов, но, если это и имеет место, то при слабой вирулентности они быстро подвергаются фагоцитозу и погибают, не вызывая какой-нибудь заметной иммунологической реакции. Наиболее примечательным является крайне низкий уровень иммунологической реакции организма животного. По-видимому, капсула, отграничивающая инфекционный очаг, препятствует проникновению за барьер не только возбудителей, но и соответствующих антигенов. Возможно, что антигены, выделяемые стрептококками, связываются in situ специфическими антителами, продуцируемыми иммунологически компетентными клетками капсулы. Подобное допущение представляется правомерным, поскольку в образовании соединительнотканной капсулы принимает участие сальник, которому, как известно, присуща функция выработки специфических антител. Следует также учесть, что процессы размножения и дезинтеграции стрептококков в инкапсулированном очаге изучены пока недостаточно. Как приводилось выше, микробы сохранялись во введенном материале более года; было также установлено, что их число остается стабильным на протяжении первой недели. Разумеется, приведенных данных недостаточно для полной характеристики описанных процессов, которая заслуживает внимания как в отношении инфекционной патологии, так и с общемикробиологической точки зрения. При всем этом нельзя пройти мимо того обстоятельства, что зараженные животные отвечали несколько более интенсивно на однократное введение стрептококковой вакцины по сравнению с незаряженными.
Как приводилось выше, оказалось очень трудным преодолеть соединительнотканный барьер. Все же у большинства животных, погибавших в результате облучения, отмечалась бактериемия. Это характеризует образованный барьер не только с механической, но и с функциональной точки зрения.
Решающим условием для воспроизведения описанной инкапсулированной стрептококковой фокальной инфекции являлась слабая вирулентность примененной культуры. Пока невозможно ответить на вопрос, почему то же самое не удается в опыте с вирулентной культурой: препятствует ли что-либо формированию барьера (например, более высокая фибринолитическая активность стрептококков), достаточен ли проскок единичных микробов для летального исхода, или развивающийся септический процесс обгоняет формирование барьера. Эти вопросы ждут своего ответа.
Вместе с тем имеются основания полагать, что, варьируя степень вирулентности культуры и условия опыта, можно рассчитывать воспроизвести хронический инфекционный процесс с более активной иммунологической характеристикой.
На основании приведенных опытов можно прийти к следующим результатам:
1. Погружение в брюшную полость перфорированной стеклянной ампулы, заполненной взвесью слабовирулентных стрептококков в кровяном агаре, вызывало у морских свинок и крыс образование инкапсулированного микробного очага, в котором микробы сохранялись более года.
2. Указанный очаг вызывал лишь весьма слабую иммунологическую реакцию у животных.
Опыты производились на взрослых морских свинках и белых крысах. Животных заражали в одних случаях мало вирулентным лабораторным штаммом стрептококка 1-го типа группы А, в S-фазе и в других - вирулентной культурой того же штамма в R-фазе. Техника заражения заключалась в следующем: одну петлю суточной культуры стрептококка на 5%-ном кровяном агаре засевали в такую же среду растопленную и остуженную до 40°. Затем, после быстрого перемешивания, засеянный агар разливали в обернутые целлофаном тонкостенные ампулы, длина которых составляла 2,5-3 см, диаметр - 0,5-0,7 см. Стенки ампул и донышки были перфорированными. По застывании агара ампулы, освобожденные от целлофановой обертки, погружали в перитонеальную полость подопытного животного через небольшой разрез в брюшной стенке. Рану закрывали наглухо двухслойным швом. Ни в одном случае не было каких-либо осложнений, мешавших быстрому заживлению операционной раны. Животные, зараженные описанным способом, находились под наблюдением от нескольких дней до 16 месяцев. Всего было оперировано 29 морских свинок и 52 крысы.
Для бактериологического исследования из трупов павших или убитых в разные сроки животных извлекали ампулы с агаром, переносили их в стерильную ступку, измельчали и после добавления необходимого количества физиологического раствора засевали на кровяной агар в чашках. Отдельно исследовали также материал, снятый ватным тампоном с внутренней и наружной стороны соединительнотканной капсулы, окружавшей ампулу в брюшной полости. Делали также посевы селезенки, брыжеечных лимфатических узлов и крови из сердца. Определение антител производили посредством реакции агглютинации (на стекле); а также реакции связывания комплемента; в последнем случае пользовались полисахаридный антигеном из культуры, которая применялась для заражения, а сыворотки разводили от 1:2 до 1 : 160. Для внутрикожных аллергических проб использовали препараты стрептококкового полисахарида и нуклеопротеида.
Ниже приводятся результаты проведенных опытов.
Опыты с вирулентной культурой. При заражении вирулентным штаммом стрептококка все подопытные морские свинки погибали в течение недели, а крысы в течение первых двух недель, при явлениях генерализованной стрептококковой инфекции. У павших животных отмечался острый перитонит, множественные абсцессы в почках и печени, из которых были выделены стрептококки. Большое количество стрептококков было обнаружено у павших животных также во всех лимфатических узлах, селезенке и крови.
Опыты с авирулентной культурой. В этих опытах животные не погибали, а их вскрывали в разные сроки после заражения для бактериологического исследования. Первые морские свинки были вскрыты через 5 суток, а последние спустя 16 месяцев после заражения. Крыс вскрывали соответственно через 2 недели и 9 месяцев. Вскрытие животных показало, что внесенная ампула с посевом авирулентного стрептококка очень скоро фиксировалась в брюшной полости и при этом развивался локальный слипчивый перитонит. В этом процессе самую активную роль играл сальник, который обволакивал перфорированную ампулу, создавая вокруг нее соединительнотканную капсулу. Тонкая капсула в дальнейшем настолько уплотнялась, что это подчас затрудняло ее вылущивание, так как на внутренней стенке образовывались соединительнотканные сосочки, которые врастали в отверстия, имевшиеся в стенках ампул. Кровяной агар в ампулах с посевом стрептококка в брюшной полости подопытного животного в течение первых двух недель приобретал бурый цвет. На более поздних сроках благодаря гемолизу и разрушению гемоглобина агар вовсе терял окраску. Посевы крови и измельченных селезенок дали отрицательный результат у всех 25 обследованных морских свинок в сроки от 5 до 480 дней после заражения и у 50 крыс, вскрытых через 10-280 дней от начала опыта. Лишь у 2 морских свинок и у 1 крысы удалось выделить стрептококки из мезентериальных лимфатических узлов. В то же время у всех животных и на всех сроках были выделены гемолитические стрептококки из содержимого ампулы и из материала, снятого с внутренней стороны соединительнотканной капсулы; они оказались идентичными исходной культуре по серологическим свойствам.
Количественные исследования были проведены лишь в течение первой недели после погружения ампул в брюшную полость животных. Они показали, что на этом сроке число жизнеспособных стрептококков в агаре оставалось стабильным. Надо добавить, что в одном из опытов спустя 3 месяца после его начала ампулы с культурой стрептококка из брюшной полости 4 морских свинок были перенесены в брюшную полость 4 других свинок, которые находились под наблюдением 4 месяца. При вскрытии у них был найден такой же инкапсулированный очаг инфекции, как у животных, зараженных исходной культурой. Попытки выделить культуру микроба из мазков с наружной стороны капсулы остались во всех случаях безрезультатными.
Серологические исследования. Были исследованы сыворотки 18 морских свинок и такого же числа крыс, полученные через 3 недели, 1,5 месяца, 6 месяцев и 1 год после заражения животных. Сыворотки 6 морских свинок вовсе не агглютинировали стрептококков; сыворотки 7 животных могли агглютинировать исходную стрептококковую культуру лишь в неразведенном виде; у 5 животных агглютинационный титр сыворотки достигал 1 : 20. Такой же результат был получен при изучении крысиных сывороток: 6 сывороток дали отрицательный результат, 3 сыворотки вызывали агглютинацию лишь в неразведенном виде и 9 сывороток имели титр 1 : 4 или 1 : 8.
Исследование посредством реакции связывания комплемента сывороток, взятых у нескольких морских свинок в ранние сроки после заражения (до 45 дней), дало отрицательный результат. В крови подопытных животных не удавалось также обнаружить стрептококкового антигена.
Воспроизведение местной аллергической реакции. В разные сроки после заражения (от 1 недели до 1 года) проверяли реакцию подопытных животных на внутрикожное введение вакцины из исходной культуры, препарата группового полисахарида, полученного по методу Ланкефильду, и стрептококкового нуклеопротеида. Местные реакции у зараженных животных лишь незначительно отличались от реакций, отмеченных у контрольных морских свинок и крыс.
Ответная реакция на подкожное введение стрептококкового антигена. Спустя год после введения ампулы с культурой авирулентного стрептококка 3 морским свинкам была однократно введена гретая стрептококковая вакцина в дозе, которая не вызвала продукции агглютининов у трех контрольных морских свинок. В то же время у подопытных животных титры сыворотки повысились через 10 дней после вакцинации: у 2 свинок с 1 : 20 до 1 : 40 и 1 : 80, а у третьей с 1 : 1 до 1 : 20.
Опыты повторного заражения. Десять крыс, зараженных культурой авирулентного стрептококка в ампуле, спустя полтора месяца вновь были подвергнуты операции. Половине животных в брюшную полость была внесена вторая ампула со свежим посевом исходного штамма авирулентного стрептококка. Другой половине крыс в брюшную полость внесли ампулы с посевом вирулентной культуры того же штамма стрептококка, что вызвало гибель всех животных от острой генерализованной стрептококковой инфекции в течение суток. В то же время следствием повторного внесения ампулы с посевом авирулентного стрептококка было развитие второго инкапсулированного очага стрептококковой инфекции с таким же затяжным течением, как и при первом заражении.
Опыты искусственного обострения процесса. В двух опытах на крысах была сделана попытка спровоцировать обострение инфекции. В одном из них зараженные животные были разделены спустя 2 недели на 2 группы, одну из которых подвергали охлаждению, поместив клетку на 2 дня в хладокамеру при температуре 2-3° под струю воздуха от вентилятора. Животных вскрывали и обследовали через 2 и 7 дней после охлаждения; одновременно исследовали и животных второй группы. В обеих группах стрептококки были выделены только из ампул и из материала, снятого с внутренней стороны капсулы.
В другом опыте крыс подвергали тотальному облучению разными дозами рентгеновых лучей спустя 1-2 недели после их заражения описанным методом. Из 25 животных, облученных 300-400 р, пали 5, и у 2 из них были высеяны из крови гемолитические стрептококки. При облучении 500-700 р пали 15 крыс, и у 9 из них посевы крови дали положительный результат. Следует, однако, отметить, что все 11 гемокультур стрептококка были получены при посеве крови, взятой в предагональной или атональной стадиях. В сыворотках крови, взятых в более ранние сроки после облучения, стрептококки не были обнаружены. Не удалось также выделить стрептококков из крови, лимфатических узлов и внутренних органов ни у одной крысы, выжившей после облучения. В этих случаях культуры микроба были получены только в посевах материала с внутренней стороны соединительнотканной капсулы и из ампулы с агаром, находившейся в брюшной полости облученных животных. Примененная в работе методика позволяла воспроизвести хронический инкапсулированный инфекционный очаг при использовании слабовирулентного штамма гемолитического стрептококка.
Образующаяся вокруг вводимого инородного тела (ампулы) плотная соединительнотканная капсула препятствует распространению стрептококков и генерализации инфекции. Нельзя, конечно, исключить прохождения немногих микробов, но, если это и имеет место, то при слабой вирулентности они быстро подвергаются фагоцитозу и погибают, не вызывая какой-нибудь заметной иммунологической реакции. Наиболее примечательным является крайне низкий уровень иммунологической реакции организма животного. По-видимому, капсула, отграничивающая инфекционный очаг, препятствует проникновению за барьер не только возбудителей, но и соответствующих антигенов. Возможно, что антигены, выделяемые стрептококками, связываются in situ специфическими антителами, продуцируемыми иммунологически компетентными клетками капсулы. Подобное допущение представляется правомерным, поскольку в образовании соединительнотканной капсулы принимает участие сальник, которому, как известно, присуща функция выработки специфических антител. Следует также учесть, что процессы размножения и дезинтеграции стрептококков в инкапсулированном очаге изучены пока недостаточно. Как приводилось выше, микробы сохранялись во введенном материале более года; было также установлено, что их число остается стабильным на протяжении первой недели. Разумеется, приведенных данных недостаточно для полной характеристики описанных процессов, которая заслуживает внимания как в отношении инфекционной патологии, так и с общемикробиологической точки зрения. При всем этом нельзя пройти мимо того обстоятельства, что зараженные животные отвечали несколько более интенсивно на однократное введение стрептококковой вакцины по сравнению с незаряженными.
Как приводилось выше, оказалось очень трудным преодолеть соединительнотканный барьер. Все же у большинства животных, погибавших в результате облучения, отмечалась бактериемия. Это характеризует образованный барьер не только с механической, но и с функциональной точки зрения.
Решающим условием для воспроизведения описанной инкапсулированной стрептококковой фокальной инфекции являлась слабая вирулентность примененной культуры. Пока невозможно ответить на вопрос, почему то же самое не удается в опыте с вирулентной культурой: препятствует ли что-либо формированию барьера (например, более высокая фибринолитическая активность стрептококков), достаточен ли проскок единичных микробов для летального исхода, или развивающийся септический процесс обгоняет формирование барьера. Эти вопросы ждут своего ответа.
Вместе с тем имеются основания полагать, что, варьируя степень вирулентности культуры и условия опыта, можно рассчитывать воспроизвести хронический инфекционный процесс с более активной иммунологической характеристикой.
На основании приведенных опытов можно прийти к следующим результатам:
1. Погружение в брюшную полость перфорированной стеклянной ампулы, заполненной взвесью слабовирулентных стрептококков в кровяном агаре, вызывало у морских свинок и крыс образование инкапсулированного микробного очага, в котором микробы сохранялись более года.
2. Указанный очаг вызывал лишь весьма слабую иммунологическую реакцию у животных.