Продукция протеиназы культурами гемолитических стрептококков, выделенными от больных скарлатиной
Протеолитическая активность гемолитических стрептококков была впервые описана Макгалумом и Хастингсом в 1899 г. у микроорганизмов, выделенных из крови при остром эндокардите. Позже на протеолитическую активность гемолитических стрептококков, выделенных из зева, указывал Фробишер. Было также показано, что некоторые штаммы гемолитических стрептококков способны переваривать М-антиген тех же микроорганизмов. Для определения стрептококковой протеиназы предложено несколько методов. Один из них, описанный Фробишером и Тоддом, основан на визуальном наблюдении денатурированных или нативных кусочков ткани и свернутых белков (по уменьшению объема). При другом методе в плотную питательную среду добавляется какой-либо свернутый белок, а о протеолитической активности судят по просветлению среды вокруг колоний засеянных стрептококков. Было также предложено использовать способность стрептококковой протеиназы расщепить М-вещество. Добавляя к исследуемой культуре известное количество М-вещества, можно затем серологическим путем определять его убыль и судить о протеолитической активности. Все эти методы оказались мало пригодными: первые два можно было использовать только для качественных исследований, а третий был трудоемким и неточным. Наибольшее распространение получил четвертый метод, основанный на способности протеиназы гидролизовать казеин. При этом используется два теста; наблюдают за свертыванием молока, что является обязательной стадией гидролиза казеина или за отщеплением тирозина. Оба теста позволяют производить количественное определение протеиназы.
По литературным данным, протеолитической активностью характеризуются гемолитические стрептококки серологических групп А, В, С, D и М, но не все штаммы указанных групп вырабатывают протеиназу, свойства которой изучены еще недостаточно. Считается, что гемолитические стрептококки продуцируют профермент, который под влиянием восстановителя или небольшого количества трипсина переходит в активный фермент. Действие фермента тормозится сульфгидрильными ядами и специфической антисывороткой. Имеются указания о серологических различиях между проферментом и активной формой фермента. Вместе с тем активные ферменты, продуцируемые стрептококками разных серологических групп, не различаются по антигенной характеристике. Сведений о патогенетической роли стрептококковой протеиназы и о ее клиническом значении почти не имеется. Келлнер и Робертсон, исследуя выделенные Эллиотом препараты стрептококковой протеиназы, нашли их токсичными для белых мышей, у которых они вызывали некротические поражения миокарда и скелетных мышц. Задачей настоящей работы было изучение степени протеолитической активности гемолитических стрептококков, выделенных при острой инфекции (скарлатине), характеристика динамики образования фермента в растущей культуре и некоторых его свойств.
Нами изучались те же культуры гемолитических стрептококков. Их с плотной кровяной среды петлей засевали на 10 мл бульона Коникова и выращивали в течение 18-20 ч при 37°, после чего центрифугировали и в надосадочной жидкости по методу Ротта определяли протеиназу. Для этого к 1 мл центрифугата, добавляли 0,5 мл 10%-ного раствора обезжиренного и лиофильно высушенного молока; раствор готовили на 0,3%-ном сульфите натрия, так что конечная концентрация последнего в тест пробирках была равна 0,1%. Пробирки инкубировались в течение 1 ч в водяной бане при 37°. Учитывались те пробирки, где произошло свертывание молока. За единицу протеиназы принималось наименьшее количество материала, способное створаживать молоко при описанных выше условиях.
Для изучения динамики образования протеиназы в процессе роста культуры ее засевали мерно в несколько колб с одинаковым количеством (100 мл) бульона Коникова. Из каждой колбы брали пробу только один раз в тот или иной срок и определяли количество жизнеспособных бактерий (посредством количественного высева на кровяной агар) и титр протеиназы. Указанные отступления от обычного метода забора последовательных проб из одной и той же колбы было связано с тем, что (как показало предварительное испытание) неизбежное при этом перемешивание культуры приводило к некоторому повышению аэрации и влекло за собой инактивацию энзима.
Для выделения протеиназы был применен метод фракционированного растворения по Диксону и Уэббу. Бульонную культуру на высоте продукции протеиназы центрифугировали и к надосадочной жидкости добавляли сернокислый аммоний до концентрации 80% от насыщенного раствора. Выпавший осадок отделяли и взвешивали в 70%-ном растворе сернокислого аммония (считая насыщенный раствор за 100%). При этом в раствор переходила из осадка часть белка. После центрифугирования к осадку добавляли новую порцию раствора сернокислого аммония меньшей концентрации (60% от насыщенного) и вновь затем центрифугировали. К осадку добавляли еще менее концентрированный раствор сернокислого аммония и повторяли эту процедуру, пока доходили до 20%-ного раствора. Затем в центрифугатах или, иначе говоря, во фракциях белков с различной растворимостью определяли наличие протеиназы. Все манипуляции, в том числе и центрифугирование, были проведены при 0°. Всего было изучено 539 штаммов от 119 больных скарлатиной, из которых 88 перенесли заболевание в легкой форме, а у 31 отмечалась скарлатина средней тяжести.
Продуцирование протеиназы гемолитическими стрептококками, выделенными при скарлатине. Из 539 изученных культур продуцировали протеиназу 187, т. е. 34,8%. Различия между культурами от больных с разными формами скарлатины (по характеру первичного токсического синдрома) были незначительными и статистически недостоверными. Вместе с тем микробная популяция, вегетировавшая в зеве больных обеих групп, не всегда была однородной в отношении протеолитической активности: лишь у небольшого числа больных все выделенные штаммы продуцировали протеиназу; чаще встречались больные, у которых лишь часть колоний в посеве давала протеиназоположительные культуры.
Сопоставление продукции протеиназы с токсигенностью культур и с выработкой других биологически активных ферментов. От 33 до 37% культур, продуцировавших О-стрептолизин или стрептокиназу или дезоксирибонуклеазы, продуцировали и протеиназу. Но почти столь же часто встречались протеиназаположительные культуры среди не вырабатывавших указанные ферменты (от 26 до 34%). Все же при более детальном анализе оказалось, что из 73 культур, вовсе не продуцировавших ДНК-аз, лишь 9 продуцировали протеиназу и притом в низких титрах; с другой стороны, у культур с высокими титрами ДНК-аз отмечалась чаще более выраженная продукция протеиназы.
Что касается соотношений между протеиназной активностью и токсигенностью, то почти половина токсигенных культур продуцировали протеиназу, а среди нетоксигенных культур протеиназоактивные встречались редко и составляли всего 12%. Надо отметить, что в этом отношении не было различий между культурами, выделенными от больных с легкой или среднетяжелой скарлатиной.
Стрептококковая популяция, вегетировавшая в зеве больных, не была однородной в отношении продукции протеиназы. Она не была однородной и в отношении продукции эритрогенного токсина. Оказалось, что по этому признаку больные с разными формами скарлатины несколько различались. Так, при легкой форме скарлатины больные, у которых все или более половины отвитых штаммов продуцировали эритрогенный токсин и протеиназу, составили меньшинство (11 на 64). Напротив, почти у половины больных (48,4%) все или большинство выделенных культур оказались неактивными. Иные соотношения отмечались при скарлатине средней тяжести: из 26 больных у 10 стрептококковая популяция состояла нацело или в большей части из микробов, продуцирующих токсин и протеиназу, а больных, у которых все или большая часть отвитых культур были инактивными, оказалось лишь 7 человек. Следует указать, что отмеченные различия между больными сравниваемых групп не были достаточно убедительны статистически, так что скорее можно говорить о тенденции, чем о безусловных различиях.
Выделение препаратов протеиназы и некоторые свойства энзима. Для выделения протеиназы был избран штамм 32/1, принадлежащий к серологической группе А. Выделение протеиназы производилось по описанной выше методике. Активной оказалась фракция белков, растворяющихся при 0° в 40%-ном растворе сернокислого аммония (считая насыщенный раствор за 100%). Эта белковая фракция после диализа и лиофилизации применялась в качестве препарата протеиназы при сравнительном изучении с трипсином. При испытании створаживающего действия трипсина на растворы молока с понижающимися концентрациями (от 10 до 0,625%) можно было отметить прямую пропорциональную зависимость между концентрацией раствора и количеством добавленного трипсина. В опытах с протеиназой подобная закономерность не отмечалась. Вместе с тем оба препарата не створаживали молока в малых концентрациях, а гидролизовали его непосредственно: последующее добавление соляной кислоты с хлористым кальцием не вызывало створаживания. Способность протеиназы гидролизовать казеин можно было показать также в опытах, где к 2%-ному раствору казеина добавляли различные количества протеиназы и после инкубации и осаждения негидролизованного белка трихлоруксусной кислотой определяли в надосадках тирозин (по Фолину). Последнего обнаруживалось тем больше, чем больше была концентрация примененного препарата протеиназы. Следует считать, что в этих опытах был применен в качестве восстановителя солянокислый цистеин вместо рекомендуемого в литературе цианистого калия. В этих же опытах можно было наблюдать и створаживающее действие протеиназы на растворы казеина. Можно отметить также, что эта реакция протекает более четко, чем реакция створаживания казеина в молоке.
Одна треть из достаточно большого числа стрептококковых культур, выделенных от больных скарлатиной, продуцировала протеиназу. Фермент накапливался в питательной среде параллельно размножению культуры и достигал наибольшей концентрации к моменту ее перехода в максимальную стационарную фазу. Его удавалось выделить и получить препараты с активностью в 40-50 раз большей по сравнению с культуральной жидкостью. По характеру действия на белковый субстрат протеиназа оказалась близкой трипсину, отличаясь от него в некоторых отношениях. Способность продуцировать протеиназу не совпадала с продукцией других биологически активных ферментов: лишь одна треть культур, продуцировавших дезоксирибонуклеазы, и менее половины токсигенных культур были протеиназоактивными. Следует вместе с тем отметить, что среди атоксигенных культур так же, как и среди культур, не продуцировавших вовсе ДНК-аз, протеиназа положительные культуры встречались редко. Как приводилось выше, стрептококковая популяция, вегетировавшая в зеве больных, была неоднородной в отношении протеиназной активности. Это было установлено в прежних исследованиях в отношении продукции ДНК-аз, а также эритрогенного токсина. Неоднородность стрептококковой популяции по токсигенности отмечалась в прежние годы у больных ангинами и у носителей стрептококка и реже всего при скарлатине. Тем большего внимания заслуживает нарастание удельного веса подобного рода больных скарлатиной, что отражает, по-видимому, эволюцию этого заболевания. Вместе с тем с явлением неоднородности микробной популяции в отношении одних или других ферментных систем связан и ряд теоретических вопросов, и он должен быть предметом углубленного микробиологического изучения. Вопрос о возможной патогенетической роли стрептококковой протеиназы не мог получить достаточного освещения только на изложенном материале. Как приводилось выше, нельзя было отметить сколько-нибудь отчетливой связи между протеиназной активностью выделенных культур и клинической формой скарлатины. По-видимому, в этом случае, как и в отношении дезоксирибонуклеаз, следует обратиться к другим заболеваниям стрептококковой этиологии.
По литературным данным, протеолитической активностью характеризуются гемолитические стрептококки серологических групп А, В, С, D и М, но не все штаммы указанных групп вырабатывают протеиназу, свойства которой изучены еще недостаточно. Считается, что гемолитические стрептококки продуцируют профермент, который под влиянием восстановителя или небольшого количества трипсина переходит в активный фермент. Действие фермента тормозится сульфгидрильными ядами и специфической антисывороткой. Имеются указания о серологических различиях между проферментом и активной формой фермента. Вместе с тем активные ферменты, продуцируемые стрептококками разных серологических групп, не различаются по антигенной характеристике. Сведений о патогенетической роли стрептококковой протеиназы и о ее клиническом значении почти не имеется. Келлнер и Робертсон, исследуя выделенные Эллиотом препараты стрептококковой протеиназы, нашли их токсичными для белых мышей, у которых они вызывали некротические поражения миокарда и скелетных мышц. Задачей настоящей работы было изучение степени протеолитической активности гемолитических стрептококков, выделенных при острой инфекции (скарлатине), характеристика динамики образования фермента в растущей культуре и некоторых его свойств.
Нами изучались те же культуры гемолитических стрептококков. Их с плотной кровяной среды петлей засевали на 10 мл бульона Коникова и выращивали в течение 18-20 ч при 37°, после чего центрифугировали и в надосадочной жидкости по методу Ротта определяли протеиназу. Для этого к 1 мл центрифугата, добавляли 0,5 мл 10%-ного раствора обезжиренного и лиофильно высушенного молока; раствор готовили на 0,3%-ном сульфите натрия, так что конечная концентрация последнего в тест пробирках была равна 0,1%. Пробирки инкубировались в течение 1 ч в водяной бане при 37°. Учитывались те пробирки, где произошло свертывание молока. За единицу протеиназы принималось наименьшее количество материала, способное створаживать молоко при описанных выше условиях.
Для изучения динамики образования протеиназы в процессе роста культуры ее засевали мерно в несколько колб с одинаковым количеством (100 мл) бульона Коникова. Из каждой колбы брали пробу только один раз в тот или иной срок и определяли количество жизнеспособных бактерий (посредством количественного высева на кровяной агар) и титр протеиназы. Указанные отступления от обычного метода забора последовательных проб из одной и той же колбы было связано с тем, что (как показало предварительное испытание) неизбежное при этом перемешивание культуры приводило к некоторому повышению аэрации и влекло за собой инактивацию энзима.
Для выделения протеиназы был применен метод фракционированного растворения по Диксону и Уэббу. Бульонную культуру на высоте продукции протеиназы центрифугировали и к надосадочной жидкости добавляли сернокислый аммоний до концентрации 80% от насыщенного раствора. Выпавший осадок отделяли и взвешивали в 70%-ном растворе сернокислого аммония (считая насыщенный раствор за 100%). При этом в раствор переходила из осадка часть белка. После центрифугирования к осадку добавляли новую порцию раствора сернокислого аммония меньшей концентрации (60% от насыщенного) и вновь затем центрифугировали. К осадку добавляли еще менее концентрированный раствор сернокислого аммония и повторяли эту процедуру, пока доходили до 20%-ного раствора. Затем в центрифугатах или, иначе говоря, во фракциях белков с различной растворимостью определяли наличие протеиназы. Все манипуляции, в том числе и центрифугирование, были проведены при 0°. Всего было изучено 539 штаммов от 119 больных скарлатиной, из которых 88 перенесли заболевание в легкой форме, а у 31 отмечалась скарлатина средней тяжести.
Продуцирование протеиназы гемолитическими стрептококками, выделенными при скарлатине. Из 539 изученных культур продуцировали протеиназу 187, т. е. 34,8%. Различия между культурами от больных с разными формами скарлатины (по характеру первичного токсического синдрома) были незначительными и статистически недостоверными. Вместе с тем микробная популяция, вегетировавшая в зеве больных обеих групп, не всегда была однородной в отношении протеолитической активности: лишь у небольшого числа больных все выделенные штаммы продуцировали протеиназу; чаще встречались больные, у которых лишь часть колоний в посеве давала протеиназоположительные культуры.
Сопоставление продукции протеиназы с токсигенностью культур и с выработкой других биологически активных ферментов. От 33 до 37% культур, продуцировавших О-стрептолизин или стрептокиназу или дезоксирибонуклеазы, продуцировали и протеиназу. Но почти столь же часто встречались протеиназаположительные культуры среди не вырабатывавших указанные ферменты (от 26 до 34%). Все же при более детальном анализе оказалось, что из 73 культур, вовсе не продуцировавших ДНК-аз, лишь 9 продуцировали протеиназу и притом в низких титрах; с другой стороны, у культур с высокими титрами ДНК-аз отмечалась чаще более выраженная продукция протеиназы.
Что касается соотношений между протеиназной активностью и токсигенностью, то почти половина токсигенных культур продуцировали протеиназу, а среди нетоксигенных культур протеиназоактивные встречались редко и составляли всего 12%. Надо отметить, что в этом отношении не было различий между культурами, выделенными от больных с легкой или среднетяжелой скарлатиной.
Стрептококковая популяция, вегетировавшая в зеве больных, не была однородной в отношении продукции протеиназы. Она не была однородной и в отношении продукции эритрогенного токсина. Оказалось, что по этому признаку больные с разными формами скарлатины несколько различались. Так, при легкой форме скарлатины больные, у которых все или более половины отвитых штаммов продуцировали эритрогенный токсин и протеиназу, составили меньшинство (11 на 64). Напротив, почти у половины больных (48,4%) все или большинство выделенных культур оказались неактивными. Иные соотношения отмечались при скарлатине средней тяжести: из 26 больных у 10 стрептококковая популяция состояла нацело или в большей части из микробов, продуцирующих токсин и протеиназу, а больных, у которых все или большая часть отвитых культур были инактивными, оказалось лишь 7 человек. Следует указать, что отмеченные различия между больными сравниваемых групп не были достаточно убедительны статистически, так что скорее можно говорить о тенденции, чем о безусловных различиях.
Выделение препаратов протеиназы и некоторые свойства энзима. Для выделения протеиназы был избран штамм 32/1, принадлежащий к серологической группе А. Выделение протеиназы производилось по описанной выше методике. Активной оказалась фракция белков, растворяющихся при 0° в 40%-ном растворе сернокислого аммония (считая насыщенный раствор за 100%). Эта белковая фракция после диализа и лиофилизации применялась в качестве препарата протеиназы при сравнительном изучении с трипсином. При испытании створаживающего действия трипсина на растворы молока с понижающимися концентрациями (от 10 до 0,625%) можно было отметить прямую пропорциональную зависимость между концентрацией раствора и количеством добавленного трипсина. В опытах с протеиназой подобная закономерность не отмечалась. Вместе с тем оба препарата не створаживали молока в малых концентрациях, а гидролизовали его непосредственно: последующее добавление соляной кислоты с хлористым кальцием не вызывало створаживания. Способность протеиназы гидролизовать казеин можно было показать также в опытах, где к 2%-ному раствору казеина добавляли различные количества протеиназы и после инкубации и осаждения негидролизованного белка трихлоруксусной кислотой определяли в надосадках тирозин (по Фолину). Последнего обнаруживалось тем больше, чем больше была концентрация примененного препарата протеиназы. Следует считать, что в этих опытах был применен в качестве восстановителя солянокислый цистеин вместо рекомендуемого в литературе цианистого калия. В этих же опытах можно было наблюдать и створаживающее действие протеиназы на растворы казеина. Можно отметить также, что эта реакция протекает более четко, чем реакция створаживания казеина в молоке.
Одна треть из достаточно большого числа стрептококковых культур, выделенных от больных скарлатиной, продуцировала протеиназу. Фермент накапливался в питательной среде параллельно размножению культуры и достигал наибольшей концентрации к моменту ее перехода в максимальную стационарную фазу. Его удавалось выделить и получить препараты с активностью в 40-50 раз большей по сравнению с культуральной жидкостью. По характеру действия на белковый субстрат протеиназа оказалась близкой трипсину, отличаясь от него в некоторых отношениях. Способность продуцировать протеиназу не совпадала с продукцией других биологически активных ферментов: лишь одна треть культур, продуцировавших дезоксирибонуклеазы, и менее половины токсигенных культур были протеиназоактивными. Следует вместе с тем отметить, что среди атоксигенных культур так же, как и среди культур, не продуцировавших вовсе ДНК-аз, протеиназа положительные культуры встречались редко. Как приводилось выше, стрептококковая популяция, вегетировавшая в зеве больных, была неоднородной в отношении протеиназной активности. Это было установлено в прежних исследованиях в отношении продукции ДНК-аз, а также эритрогенного токсина. Неоднородность стрептококковой популяции по токсигенности отмечалась в прежние годы у больных ангинами и у носителей стрептококка и реже всего при скарлатине. Тем большего внимания заслуживает нарастание удельного веса подобного рода больных скарлатиной, что отражает, по-видимому, эволюцию этого заболевания. Вместе с тем с явлением неоднородности микробной популяции в отношении одних или других ферментных систем связан и ряд теоретических вопросов, и он должен быть предметом углубленного микробиологического изучения. Вопрос о возможной патогенетической роли стрептококковой протеиназы не мог получить достаточного освещения только на изложенном материале. Как приводилось выше, нельзя было отметить сколько-нибудь отчетливой связи между протеиназной активностью выделенных культур и клинической формой скарлатины. По-видимому, в этом случае, как и в отношении дезоксирибонуклеаз, следует обратиться к другим заболеваниям стрептококковой этиологии.