Устойчивость стрептокиназы к температурным воздействиям
Препараты стрептокиназы применяются в клинике для растворения кровяных сгустков и гнойно-фибринозных выпотов, причем в последнем случае добавляют дезоксирибонуклеазу. Стрептокиназа применяется также как активатор для получения препаратов фибринолизина крови, применяющегося с терапевтической целью. В лаборатории стрептокиназу применяют для количественного определения антистрептокиназы в сыворотках больных различными заболеваниями стрептококковой этиологии. Понятно, что вопрос об условиях хранения препаратов имеет серьезное значение. В литературе имеются сведения о том, что даже кратковременное кипячение полностью не уничтожает специфическую активность стрептокиназы, но при этом отмечается значительное снижение титра.
Наш опыт практической работы с очищенными и неочищенными препаратами стрептокиназы показал, что чем выше степень чистоты препарата, тем он менее стоек при хранении в растворе. Ниже приводятся результаты сравнительного изучения термоустойчивости растворов стрептокиназы различной степени очистки. Препараты стрептокиназы были приготовлены из концентрированного фильтрата культуры гемолитического стрептококка группы А (серотипа 28) по методу Коникова и частично очищены от балластных белков по методу, описанному в предыдущей работе Г. Б. Савельвольф. В неочищенном препарате содержалось 5700 Ф. ЕД по Коникову на 1 мг белка, активность очищенного препарата выражалась 500 000 Ф. ЕД на 1 мг белка. Испытания термоустойчивости растворов стрептокиназы производили в концентрациях, близких к рабочим растворам, применяемым для определения антистрептокиназы и в концентрациях в 200-100 раз больших. Растворы выдерживались при температуре рефрижератора (2-4°), в комнате (20°), в условиях термостата (37°), а также подвергались прогреву при 56, 80 и 100°. Определение активности стрептокиназы производилось по методу Коникова в разные сроки хранения (от 30 мин до нескольких недель). Чувствительность метода позволяет определять до 0,5 ед. стрептокиназы, поэтому даже при работе с разведенными растворами, содержащими 50-100 Ф. ЕД Коникова, можно устанавливать 0,5-1% первоначальной активности.
Разведенные растворы очищенной стрептокиназы (50-100 ед./мл) очень мало стойки и даже в условиях ледника через 24 ч сохраняли только 23%, а через 2 недели - всего 2% первоначальной активности. Неочищенная стрептокиназа той же концентрации оказалась более стойкой при низкой температуре, и по прошествии суток в ней оставалось еще 60%, а через 2 недели 18% первоначальной активности. Дальнейшее падение активности неочищенных препаратов шло медленнее, и через 40 дней в них сохранялось 10% первоначальной активности стрептокиназы. Концентрированные растворы (10000 ед./мл) были более стойкими, чем разведенные, при хранении на холоду. Но и в этом случае отмечалась меньшая устойчивость очищенной стрептокиназы по сравнению с неочищенной. Так, в растворе очищенного препарата сохранилось через 2 недели 25% первоначальной активности, в то время как активность неочищенной стрептокиназы снизилась за этот срок лишь на 30%.
При комнатной температуре и в условиях термостата отмечалась более интенсивная инактивация стрептокиназы и разведенные растворы как очищенных, так и неочищенных препаратов полностью теряли активность спустя сутки и даже в концентрированных растворах оставалось к этому сроку 18%-10% активности, если речь шла об очищенном препарате, и 60-20% в неочищенной стрептокиназе. Заслуживает внимания, что разведенные препараты (независимо от очистки) теряли уже через 1 ч в условиях термостата половину активности.
Вместе с тем растворы стрептокиназы до некоторой степени выдерживали прогревание при 56 и 80° и даже в разведенных растворах частично сохраняли активность (18-23%) после двухчасового прогрева при 56° и получасовой выдержки при 80°. Кипячение в течение получаса инактивировало почти полностью разведенные растворы, но в концентрированных растворах сохранялась небольшая остаточная активность и после часового кипячения. Двадцатиминутное автоклавирование (110°) инактивирует препараты полностью.
При хранении разведенных растворов стрептокиназы в замороженном состоянии отмечалось полное исчезновение активности через 5 месяцев хранения, в концентрированных растворах активность сохранялась еще спустя 18 месяцев: в очищенных препаратах оставалось 10-30%, а в неочищенных 50-80% первоначальной активности.
Большая устойчивость неочищенных препаратов по сравнению с очищенными заставляла думать о предохраняющей роли примесей. Для проверки этого предположения были проведены дополнительные опыты, в которых к очищенным препаратам стрептокиназы разной концентрации (50-100 и 10 000 ед./мл) добавляли разные количества белков: желатина от 1 до 4%, бульона по прописи Коникова от 50 до 80%, нормальной прогретой кроличьей сыворотки от 1 до 16%. Пробирки, содержащие стрептокиназу с добавлением одного из вышеуказанных белков, а также без них помещали в термостат при 37° (с добавлением мертиолата натрия). Пробы отбирались в течение суток через те же промежутки времени, что и в предыдущих исследованиях. Оказалось, что добавление стабилизирующих белков хорошо предохраняло даже разведенные препараты от инактивации и через сутки в них оставалось до 80-90% первоначальной активности в отличие от контрольных препаратов без стабилизатора, которые инактивировались полностью. Таким образом, при работе со стрептокиназой следует учитывать ее особенности: с одной стороны, относительную термостабильность, при кратковременном воздействии повышенных температур, инактивацию при многочасовом содержании при 37° и при комнатной температуре и предохранение от инактивации при добавлении белков. Следует подчеркнуть, что в лиофильно высушенных препаратах, сохраняемых в рефрижераторе в эксикаторе над хлористым кальцием, исходная активность стрептокиназы не снижалась в течение нескольких лет. На основании приведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Растворы очищенных препаратов стрептокиназы менее стойки по отношению к температурным воздействиям по сравнению с неочищенными.
2. Концентрированные растворы стрептокиназы более стойки к температурным воздействиям, чем разведенные.
3. Наряду с малой стойкостью растворов стрептокиназы к температурным воздействиям наблюдается их относительная термостабильность к кратковременному воздействию температуры (56-80°).
4. Добавление стабилизирующих белков сохраняет активность препаратов стрептокиназы.
5. Активность лиофильно высушенных препаратов сохраняется неизменной в течение длительного времени.
Наш опыт практической работы с очищенными и неочищенными препаратами стрептокиназы показал, что чем выше степень чистоты препарата, тем он менее стоек при хранении в растворе. Ниже приводятся результаты сравнительного изучения термоустойчивости растворов стрептокиназы различной степени очистки. Препараты стрептокиназы были приготовлены из концентрированного фильтрата культуры гемолитического стрептококка группы А (серотипа 28) по методу Коникова и частично очищены от балластных белков по методу, описанному в предыдущей работе Г. Б. Савельвольф. В неочищенном препарате содержалось 5700 Ф. ЕД по Коникову на 1 мг белка, активность очищенного препарата выражалась 500 000 Ф. ЕД на 1 мг белка. Испытания термоустойчивости растворов стрептокиназы производили в концентрациях, близких к рабочим растворам, применяемым для определения антистрептокиназы и в концентрациях в 200-100 раз больших. Растворы выдерживались при температуре рефрижератора (2-4°), в комнате (20°), в условиях термостата (37°), а также подвергались прогреву при 56, 80 и 100°. Определение активности стрептокиназы производилось по методу Коникова в разные сроки хранения (от 30 мин до нескольких недель). Чувствительность метода позволяет определять до 0,5 ед. стрептокиназы, поэтому даже при работе с разведенными растворами, содержащими 50-100 Ф. ЕД Коникова, можно устанавливать 0,5-1% первоначальной активности.
Разведенные растворы очищенной стрептокиназы (50-100 ед./мл) очень мало стойки и даже в условиях ледника через 24 ч сохраняли только 23%, а через 2 недели - всего 2% первоначальной активности. Неочищенная стрептокиназа той же концентрации оказалась более стойкой при низкой температуре, и по прошествии суток в ней оставалось еще 60%, а через 2 недели 18% первоначальной активности. Дальнейшее падение активности неочищенных препаратов шло медленнее, и через 40 дней в них сохранялось 10% первоначальной активности стрептокиназы. Концентрированные растворы (10000 ед./мл) были более стойкими, чем разведенные, при хранении на холоду. Но и в этом случае отмечалась меньшая устойчивость очищенной стрептокиназы по сравнению с неочищенной. Так, в растворе очищенного препарата сохранилось через 2 недели 25% первоначальной активности, в то время как активность неочищенной стрептокиназы снизилась за этот срок лишь на 30%.
При комнатной температуре и в условиях термостата отмечалась более интенсивная инактивация стрептокиназы и разведенные растворы как очищенных, так и неочищенных препаратов полностью теряли активность спустя сутки и даже в концентрированных растворах оставалось к этому сроку 18%-10% активности, если речь шла об очищенном препарате, и 60-20% в неочищенной стрептокиназе. Заслуживает внимания, что разведенные препараты (независимо от очистки) теряли уже через 1 ч в условиях термостата половину активности.
Вместе с тем растворы стрептокиназы до некоторой степени выдерживали прогревание при 56 и 80° и даже в разведенных растворах частично сохраняли активность (18-23%) после двухчасового прогрева при 56° и получасовой выдержки при 80°. Кипячение в течение получаса инактивировало почти полностью разведенные растворы, но в концентрированных растворах сохранялась небольшая остаточная активность и после часового кипячения. Двадцатиминутное автоклавирование (110°) инактивирует препараты полностью.
При хранении разведенных растворов стрептокиназы в замороженном состоянии отмечалось полное исчезновение активности через 5 месяцев хранения, в концентрированных растворах активность сохранялась еще спустя 18 месяцев: в очищенных препаратах оставалось 10-30%, а в неочищенных 50-80% первоначальной активности.
Большая устойчивость неочищенных препаратов по сравнению с очищенными заставляла думать о предохраняющей роли примесей. Для проверки этого предположения были проведены дополнительные опыты, в которых к очищенным препаратам стрептокиназы разной концентрации (50-100 и 10 000 ед./мл) добавляли разные количества белков: желатина от 1 до 4%, бульона по прописи Коникова от 50 до 80%, нормальной прогретой кроличьей сыворотки от 1 до 16%. Пробирки, содержащие стрептокиназу с добавлением одного из вышеуказанных белков, а также без них помещали в термостат при 37° (с добавлением мертиолата натрия). Пробы отбирались в течение суток через те же промежутки времени, что и в предыдущих исследованиях. Оказалось, что добавление стабилизирующих белков хорошо предохраняло даже разведенные препараты от инактивации и через сутки в них оставалось до 80-90% первоначальной активности в отличие от контрольных препаратов без стабилизатора, которые инактивировались полностью. Таким образом, при работе со стрептокиназой следует учитывать ее особенности: с одной стороны, относительную термостабильность, при кратковременном воздействии повышенных температур, инактивацию при многочасовом содержании при 37° и при комнатной температуре и предохранение от инактивации при добавлении белков. Следует подчеркнуть, что в лиофильно высушенных препаратах, сохраняемых в рефрижераторе в эксикаторе над хлористым кальцием, исходная активность стрептокиназы не снижалась в течение нескольких лет. На основании приведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Растворы очищенных препаратов стрептокиназы менее стойки по отношению к температурным воздействиям по сравнению с неочищенными.
2. Концентрированные растворы стрептокиназы более стойки к температурным воздействиям, чем разведенные.
3. Наряду с малой стойкостью растворов стрептокиназы к температурным воздействиям наблюдается их относительная термостабильность к кратковременному воздействию температуры (56-80°).
4. Добавление стабилизирующих белков сохраняет активность препаратов стрептокиназы.
5. Активность лиофильно высушенных препаратов сохраняется неизменной в течение длительного времени.