Определение токсигенности гемолитических стрептококков
Несколько лет тому назад М. А. Зеликина предложила определять токсигенность гемолитических стрептококков в опыте in vitro посредством реакции связывания комплемента, пользуясь для этого антитоксической кроличьей сывороткой и фильтратами (или центрифугатами) бульонных культур исследуемых микробов. Метод был пригоден для количественных определений и оказался достаточно чувствительным, поскольку позволял обнаруживать токсин при концентрации 2000 кожных доз в 1 мл. Нами было затем показано, что для констатации токсинообразования и для отбора соответствующих стрептококковых культур можно с успехом использовать метод преципитации в геле. Он оказался простым и удобным, в особенности при широких клинико-эпидемиологических обследованиях. Вопрос о возможности использовать этот метод для количественных определений остался открытым.
Как известно, даже в отношении дифтерийных культур соответствующие данные противоречивы: наряду1 с авторами, указывающими, что число специфических полос преципитации находится в прямой зависимости от количества токсина, другие считают, что количество полос преципитации не характеризуют степени токсигенности испытуемой культуры. Имеется предложение судить о количестве бактериального токсина по скорости появления преципитата около растущей культуры. Мы исследовали 169 культур гемолитического стрептококка, отобранных по реакции преципитации в агаре, в реакции связывания комплемента по Зеликиной в количественной раститровке.
Из наших данных видно, что только 12 культур образовывали преципитат, состоящий из двух полос. Они принадлежали к числу 143 культур, которые продуцировали слабые или средней силы токсины. Все 26 высоко токсигенных культур дали одну полосу преципитата.
Таким образом, число полос преципитации не отражало в наших опытах степени токсигенности стрептококковых культур. Следовало испытать, не будет ли отражать степень токсигенности культур ширина зоны преципитации в геле при исследовании соответствующих фильтратов. Были поставлены модельные опыты со стандартным стрептококковым термолабильным токсином и соответствующей антитоксической сывороткой. На хорошо обезжиренное предметное стекло (4x9 см) наносили 4 мл агара, смешанного со стрептококковой антитоксической сывороткой (0,4 мл). В застывшем агаровом слое вырезывали по средней линии стекла 3-4 лунки (диаметром 0,5 см), в которые вносили по 0,03 мл токсина в разных разведениях. Через час вокруг лунки с токсином появлялся преципитат в виде мутного кольца, ширина которого с течением времени увеличивалась и достигала максимума через 18-24 ч, когда и учитывали результат. Можно было видеть, что ширина зоны преципитата не находилась в прямой зависимости от титра антитоксической сыворотки и могла быть более значительной в опыте с сывороткой меньшего титра. Но во всех случаях ширина зоны преципитации убывала с уменьшением количества токсина, вносимого в лунки. Чувствительность опыта была низкой: количество токсина, открываемое с помощью кроличьих антитоксических сывороток, было в пределах 160 000 кожных доз в 1 мл, а лошадиная антитоксическая сыворотка давала преципитат, если в 1 мл испытуемого токсина находилось не менее 300 000 кожных доз. Увеличение количества антитоксической сыворотки, добавляемой в агар, не повысило чувствительности использованного метода.
По описанному методу были поставлены опыты с фильтратами 19 бульонных культур свежевыделенных гемолитических стрептококков. При исследовании в реакции связывания комплемента с антитоксической сывороткой лишь 5 фильтратов реагировали с антитоксической сывороткой, будучи разведены 1 : 80, что соответствовало титру в 80-160 тыс. кожных доз в 1 мл; в остальных фильтратах содержание токсина было меньшим, а в 4 фильтратах его не удалось обнаружить. Как и следовало ожидать, только "сильные" токсины указанных 5 фильтратов оказались способными образовывать вокруг лунок кольца преципитата, причем ширина этих колец не превышала 1-2 мм.
Таким образом, следовало прийти к заключению, что метод преципитации в геле, будучи простым и удобным для отбора токсигенных культур, не может быть использован в клинико-эпидемиологических исследованиях для количественной характеристики токсинообразующей способности разных культур. Для этой цели следует пользоваться реакцией связывания комплемента по Зеликиной. Вместе с тем испытанная нами модификация (добавление антитоксической сыворотки в агар) может найти применение в экспериментальных исследованиях и, возможно, в производственной практике.
Как известно, даже в отношении дифтерийных культур соответствующие данные противоречивы: наряду1 с авторами, указывающими, что число специфических полос преципитации находится в прямой зависимости от количества токсина, другие считают, что количество полос преципитации не характеризуют степени токсигенности испытуемой культуры. Имеется предложение судить о количестве бактериального токсина по скорости появления преципитата около растущей культуры. Мы исследовали 169 культур гемолитического стрептококка, отобранных по реакции преципитации в агаре, в реакции связывания комплемента по Зеликиной в количественной раститровке.
Из наших данных видно, что только 12 культур образовывали преципитат, состоящий из двух полос. Они принадлежали к числу 143 культур, которые продуцировали слабые или средней силы токсины. Все 26 высоко токсигенных культур дали одну полосу преципитата.
Таким образом, число полос преципитации не отражало в наших опытах степени токсигенности стрептококковых культур. Следовало испытать, не будет ли отражать степень токсигенности культур ширина зоны преципитации в геле при исследовании соответствующих фильтратов. Были поставлены модельные опыты со стандартным стрептококковым термолабильным токсином и соответствующей антитоксической сывороткой. На хорошо обезжиренное предметное стекло (4x9 см) наносили 4 мл агара, смешанного со стрептококковой антитоксической сывороткой (0,4 мл). В застывшем агаровом слое вырезывали по средней линии стекла 3-4 лунки (диаметром 0,5 см), в которые вносили по 0,03 мл токсина в разных разведениях. Через час вокруг лунки с токсином появлялся преципитат в виде мутного кольца, ширина которого с течением времени увеличивалась и достигала максимума через 18-24 ч, когда и учитывали результат. Можно было видеть, что ширина зоны преципитата не находилась в прямой зависимости от титра антитоксической сыворотки и могла быть более значительной в опыте с сывороткой меньшего титра. Но во всех случаях ширина зоны преципитации убывала с уменьшением количества токсина, вносимого в лунки. Чувствительность опыта была низкой: количество токсина, открываемое с помощью кроличьих антитоксических сывороток, было в пределах 160 000 кожных доз в 1 мл, а лошадиная антитоксическая сыворотка давала преципитат, если в 1 мл испытуемого токсина находилось не менее 300 000 кожных доз. Увеличение количества антитоксической сыворотки, добавляемой в агар, не повысило чувствительности использованного метода.
По описанному методу были поставлены опыты с фильтратами 19 бульонных культур свежевыделенных гемолитических стрептококков. При исследовании в реакции связывания комплемента с антитоксической сывороткой лишь 5 фильтратов реагировали с антитоксической сывороткой, будучи разведены 1 : 80, что соответствовало титру в 80-160 тыс. кожных доз в 1 мл; в остальных фильтратах содержание токсина было меньшим, а в 4 фильтратах его не удалось обнаружить. Как и следовало ожидать, только "сильные" токсины указанных 5 фильтратов оказались способными образовывать вокруг лунок кольца преципитата, причем ширина этих колец не превышала 1-2 мм.
Таким образом, следовало прийти к заключению, что метод преципитации в геле, будучи простым и удобным для отбора токсигенных культур, не может быть использован в клинико-эпидемиологических исследованиях для количественной характеристики токсинообразующей способности разных культур. Для этой цели следует пользоваться реакцией связывания комплемента по Зеликиной. Вместе с тем испытанная нами модификация (добавление антитоксической сыворотки в агар) может найти применение в экспериментальных исследованиях и, возможно, в производственной практике.