Иммунологические данные при аутоиммунных гемолитических анемиях
Свойства антител. Наличие тепловых аутоантител к эритроцитам - практически основная причина АИГА. Этот факт был установлен в 72- 85% случаев при анализе значительного статистического материала. Приблизительно в 98% случаев это касается антител класса IgG, в 6% случаев - IgA или IgM. Субклассы IgG распределяются в соотношении 40:10:9:3. Иногда встречают одновременно антитела разных классов. Анализ L-цепей также свидетельствует о поликлональном характере антител; тем не менее в ряде случаев удалось идентифицировать моноклональные антитела.
Антитела другого вида, ответственные за аутоиммунные гемолитические процессы, обладают особыми свойствами: они не способны непосредственно вызывать агглютинацию или гемолиз. Ввиду их моноклональности они были обозначены как «неполные антитела», однако условием определения активности антител класса IgG является двухвалентность. При объяснении эффекта моноклональных антител исходят из следующих представлений:
1. Наличие одного участка связывания с антигеном, что ограничивает функциональную активность антител. С помощью макромолекулярных веществ, ферментов, а также антиглобулиновой сыворотки можно воссоздать 2-й участок связывания с антигеном, изменить и восстановить пространственную структуру антител в соответствии с конфигурацией молекулы IgG.
2. Определенное структурное соотношение в системе антиген - антитело. По-видимому, локализация антигена такова, что малая молекула IgG не может обеспечить связывания между двумя эритроцитами. Обработка эритроцитов протеолитическим ферментом может привести к изменению пространственного соотношения, что способствует агглютинации.
3. Влияние поверхностного заряда. Известно, что активность антител вызывает снижение поверхностного заряда эритроцитов. Под воздействием неполных антител этот эффект оказывается недостаточным для реакции агглютинации. Положительный результат возможен при изменении ионной силы, добавлении макромолекул и т. д.
Фактически ни одна из этих теорий не объясняет в полной мере данного феномена. Вывод о выработке моновалентных структур нельзя делать на основании прямой реакции агглютинации, для этого необходимы соответствующие модификации.
Антиглобулиновый тест. С помощью прямого АГТ удалось установить, что, как правило, именно антитела связываются на поверхности эритроцитов. Путем элюции (нагревание, окисление) их можно выделить и перенести на другие клетки, однако детальные исследования показали, что это не всегда объясняется связыванием аутоантител; в реакции участвуют и компоненты комплемента, особенно С3 и С4 (сублитическое связывание комплемента). В опытах были определены три способа сенсибилизации эритроцитов:
- IgG и комплементом (45-60%),
- IgG (30-45%),
- комплементом (5-17%).
В первом случае связывание компонентов комплемента происходит в результате фиксации антител на эритроцитах. Остается неясным, почему эта реакция возможна без участия комплемента. Было показано, что это обусловлено специфичностью антител к определенному антигену. Известную роль, по-видимому, играет также пространственная структура антител, так как полагают, что для связывания комплемента необходимы две близко расположенные молекулы IgG. К примеру, Rh-детерминанты находятся слишком далеко друг от друга. Процесс связывания на эритроцитах исключительно одних компонентов комплемента характерен для болезни холодовых агглютининов, при холодовой гемоглобинурии и гемолитических анемиях, вызванных приемом лекарственных препаратов. При нормальной температуре холодовые антитела не связаны с антигеном. Все же достаточно чувствительные методы позволили выявить lg и при сенсибилизации эритроцитов комплементом. В остальных случаях предполагают, что эритроциты, нагруженные комплементом, появляются в результате потери антител при отмывании, фиксации комплемента путем обратной связи с комплексом антиген - антитело, а также вследствие неиммунной природы связывания комплемента. Указанные типы сенсибилизации эритроцитов характерны и для вторичных форм аутоиммунной гемолитической анемии. Так, при системной красной волчанке обнаруживают эритроциты 1-го и 3-го типов, во время активного гемолиза - прежде всего 1-го типа.
С помощью соответствующих модификаций можно идентифицировать класс и вид антител, например при использовании моноспецифических меченых антисывороток.
Положительный прямой АГТ при явных признаках гемолиза позволяет подтвердить диагноз гемолитической анемии, вызванной тепловыми аутоантителами. Иногда это характерно для случаев аутоиммунной анемии, обусловленных лекарственный терапией, и очень редко положительный прямой АГТ встречается у здоровых лиц. Доказательство селективного связывания комплемента на эритроцитах, полученное с помощью сыворотки анти-С3, свидетельствует скорее всего об активности холодовых антител. Обычно в этом убеждаются, когда у больных безуспешно пытаются отделить сыворотку и эритроциты при 37 °С. Антикомплементарный тест может оказаться положительным примерно у 8% больных, у которых гемолиз клинически не проявляется.
АГТ не служит показателем тяжести заболевания или средством терапевтического контроля. Кроме реакции связывания С3-компонента комплемента и определения уровня антител, используют полуколичественный метод, при котором эритроциты инкубируют с разными разведениями антисыворотки против lg человека.
Результаты РСК на эритроцитах позволили объяснить наблюдение, что уровень комплемента в сыворотке часто снижен, хотя и реже, чем при аутоиммунной гемолитической анемии, обусловленной Холодовыми агглютининами. Наряду с данными о снижении общей гемолитической активности сообщалось о случаях преимущественного дефицита С3.
Несвязанные антитела. Помимо антител, фиксированных на клетках и выявляемых в прямом АГТ, в 50-60% наблюдений описаны несвязанные аутоантитела. Они были продемонстрированы с помощью непрямого АГТ. О свойствах аутоантител судят по их способности вступать в реакцию с аутологичными клетками. Для этой цели эритроциты больного не всегда пригодны: наличие эритроцитов, нагруженных аутоантителами и комплементом, создает дополнительные сложности в работе.
При выявлении несвязанных антител определенную ценность имеет информация о специфичности связанных антител, которую можно получить путем анализа эритроцитов больного. Так, если показана анти-С-специфичность, то для выявления несвязанных антител используют С+-эритроциты. Обработка тест-эритроцитов ферментом значительно повышает чувствительность метода. Различие в специфичности свободных и связанных антител свидетельствует о том, что мы имеем дело с присутствием аллоантител. Значение несвязанных аутоантител еще неясно. Связывание их на поверхности эритроцитов - это динамический, обратимый процесс, поэтому часть антител остается в сыворотке в свободном состоянии. Их титр зависит как от количества молекул, так и от аффинности последних к рецепторам на эритроцитах.
Наряду с этим выявляют антитела, реагирующие только с эритроцитами, обработанными ферментом, обычно они относятся к классу IgM. Их роль также не вполне ясна. Для идентификации антител, имеющих патогенетическое значение и реагирующих с собственными эритроцитами, в первую очередь проводят анализ элюатов, снимаемых с эритроцитов. Безусловно, не следует допускать, чтобы по недосмотру были элюированы и неспецифически адсорбированные белки. В частности, известен так называемый Ogata-феномен, когда при специфической реакции антиэритроцитарных антител с соответствующим антигеном происходило связывание антител другой специфичности.
Температура, рН и другие факторы. При некотором окислении среды можно добиться усиления реакции агглютинации и гемолиза. Оптимальны условия при рН 6,5-7,0 и нормальной температуре организма, однако были описаны единичные случаи, когда эффект наблюдали при 40 °С или 10-20 °С. Установлено, что гепарин подавляет реакцию агглютинации, а положительный АГТ после его добавления становится отрицательным. Результаты этих опытов позволили объяснить известные терапевтические эффекты. Хотя точные механизмы данного явления еще не раскрыты, предполагают, что определенную роль играют реакции гепарина с С3-компонентом комплемента. Кроме того, не исключено его влияние на аутоантитела или их реакцию с поверхностными антигенами эритроцитов.
Антиген. Тот факт, что тепловые аутоантитела реагируют с большим количеством эритроцитов, долгое время объясняли проявлением неспецифических реакций. В исследованиях с применением эритроцитов разных групп крови человека при титровании сывороток имеют место значительные количественные различия. В 30-40% (первичные формы и комбинация с В-клеточной пролиферацией) отмечена Rh-специфичность. Так, были обнаружены антитела к антигенам системы резус, например, анти-е, анти-с и анти-d. В большинстве случаев изучаемые специфичности не точно соответствовали Rh-изоантителам.
Следует различать аллоантитела сходной специфичности. Два первых типа антител, очевидно, направлены против главной структуры или исходного вещества антигена Rh. С этой точки зрения становится понятным феномен положительной реакции антител человека с эритроцитами некоторых видов человекообразных обезьян. Продукция антител может быть вызвана и перекрестно реагирующими антигенами. Существуют разные номенклатуры антигенов резус, основанные, в частности, на генетических взаимоотношениях антигенов этой системы.
Изменения в картине костного мозга. Развитие гипоплазии пытались объяснить действием факторов, повреждающих костный мозг, однако в подавляющем большинстве исследований было показано, что антиэритроцитарные аутоантитела обладают способностью реагировать с ядросодержащими предшественниками эритроцитов, включая эритробласты. Поскольку в системе кровь - костный мозг отсутствует какой-либо барьер, то из этого следует, что антитела могут оказывать цитотоксическое действие на клетки костного мозга. Выраженность его зависит главным образом от титра и аффинности аутоантител. При выработке низкоаффинных антител и в невысоком титре в картине костного мозга, как правило, преобладает стимуляция. Напротив, при значительных титрах и/или высокой аффинности антител может проявляться их цитотоксический эффект, что соответствует нарастанию признаков аплазии костного мозга. Эти данные были с достаточной очевидностью продемонстрированы на экспериментальных животных. По-видимому, сходные механизмы действуют главным образом при хронически прогредиентном течении заболевания. Различие острых апластических кризов, вероятно, обусловлено влиянием дополнительных токсических факторов (инфекция, медикаменты и др.).
Панцитопения. Этиология некоторых форм изучена не полностью. В качестве одной из причин называют активацию моноцитарно-макрофагальной системы. Другое представление связано с наблюдением, что антигены групп крови присутствуют также на тромбоцитах и лейкоцитах. И наконец, панцитопения может развиться в результате нарушений механизмов иммунорегуляции, что приводит к выработке аутоантител к лейкоцитам или тромбоцитам. Таким образом, становится понятным утверждение некоторых авторов, что аутоиммунная гемолитическая анемия и идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП) - это лишь два разных проявления одного иммунного дефекта. Действительно, при ИТП антиглобулиновый тест сравнительно часто оказывается положительным, а в ряде клинических случаев развивается выраженная анемия.
Определение тепловых аутоантител. В целом антиэритроцитарные тепловые аутоантитела являются неполными, только в редких случаях они вызывают агглютинацию в солевой среде, поэтому для их обнаружения необходимы особые методы. В клинических лабораториях используют в основном антиглобулиновый тест, метод с добавлением коллоидных макромолекулярных веществ, а также технику обработки ферментами.
Дополнительные реакции. Еще в 1945 г. было впервые показано, что добавление раствора альбумина к суспензии эритроцитов, нагруженных неполными тепловыми аутоантителами, приводит к агглютинации. Эта реакция получила название «конглютинация». В последние годы для этой цели были предложены также декстран, поливинилпирролидон (ПВП) и карбоксиметилцеллюлоза. Наиболее результативным оказался метод с ПВП.
Антиглобулиновый тест впервые разработали Coombs и соавт. Принцип пробы Кумбса состоит в том, что на эритроцитах фиксируются моновалентные антитела, которые с помощью антиглобулиновой сыворотки могут воссоединиться в полные двухвалентные антитела. Наряду с прямым АГТ для выявления неполных антител был предложен и непрямой вариант, при котором исследуемую сыворотку инкубируют с эритроцитами и непосредственно после этого добавляют антиглобулиновую сыворотку. Обычно иммунную антисыворотку против глобулинов человека получают от кроликов и коз. Для иммунизации животных используют как глобулииовую фракцию нормальной сыворотки, так и образцы сывороток, содержащих аутоантитела. Наряду с этими «антисыворотками широкого спектра» можно применять и моноспецифические антисыворотки или моноклональные Ат к отдельным классам lg.
В отличие от дополнительных методов основу АГТ составляет специфическая иммунная реакция. Тем не менее ряд данных указывает на ее недостаточную надежность:
- антиглобулиновые сыворотки проявляют достаточную вариабельность в зависимости от титра, аффинности и т. д.;
- прямой АГТ оказывается положительным лишь тогда, когда минимум 400 молекул антител связываются на поверхности эритроцита.
Поскольку активный цитолиз возможен уже при фиксации примерно 20 молекул, то неудивительно, что в определенном проценте случаев АГТ не воспроизводится. Более чувствительна модификация метода, при которой титр антител определяют с помощью РСК (тест потребления антител при связывании комплемента). От разной степени «нагрузки» эритроцитов не всегда зависят показатели по крайней мере прямого АГТ. Между тем избыток антител или антигена может привести к ложноотрицательным результатам, поэтому исследование проводят с различными разведениями сыворотки.
Вопреки прежним представлениям удалось показать, что lg могут неспецифически адсорбироваться на поверхности эритроцитов и полностью не удаляются даже после неоднократного отмывания клеток. Агглютинацию же вызывает реакция антиглобулиновой фракции только со специфически связанными lg. Еще не вполне ясно, какова роль пространственных структурных различий между специфически и неспецифически связанными lg. Ответ на этот вопрос имеет практическое значение, так как позволяет судить о специфичности АГТ.
Обработка эритроцитов протеолитическими ферментами. Протеолитические ферменты холерного вибриона способствуют реакции агглютинации с неполными антителами. Подобное действие на эритроциты оказывает трипсин, в большинстве случаев для этой цели используют папаин и бромелин. Начальный этап реакции - получение папаинизированных эритроцитов. Последующая инкубация этих эритроцитов с сыворотками, содержащими неполные антитела, приводит к четко выраженной агглютинации. Сходные результаты получают и при активации бромелином, который представляет собой смесь протеолитических ферментов; это довольно чувствительный тест, поскольку реакция происходит в течение 15 мин при комнатной температуре. Методы с использованием фицина (энзим из растений семейства фиговых) и проназы распространены относительно меньше. Еще не вполне ясен механизм, лежащий в основе агглютинации неполных антител. Наиболее вероятны следующие предположения:
- протеолитические ферменты как бы обнажают поверхностную структуру антигена таким образом, что значительное количество антител может фиксироваться на клеточной поверхности;
- обработка эритроцитов приводит к такому изменению конфигурации неполных антител, что они приобретают свойства двухвалентных антител. Один из вариантов этой теории: изменение клеточной поверхности способствует реакции между близко расположенными эритроцитами;
- в процессе обработки ферментом с поверхности эритроцитов отщепляется N-ацетилнейраминовая кислота. Это сопровождается уменьшением межклеточных сил отталкивания, что способствует агглютинации.
Не исключено, что указанные факторы действуют как синергисты. Полученные результаты следует интерпретировать с определенной предосторожностью, так как у некоторых здоровых лиц выявляют антитела, реагирующие с эритроцитами, обработанными протеазой, разумеется, в очень низком титре.
Ложноотрицательные реакции наблюдают в тех случаях, когда соответствующие антигены, например М и N, подвергаются разрушению. Считают, что этот эффект не имеет практического значения при выявлении тепловых аутоантител.
Указанные методы не аналогичны и поэтому лишь условно сопоставимы. Наиболее воспроизводимыми и информативными считаются тесты с использованием антиглобулиновой сыворотки и ферментов. Целесообразно воспроизводить по крайней мере два разных метода, так как отрицательные результаты реакции не всегда свидетельствуют об отсутствии соответствующих антител. Прямой АГТ служит прежде всего методом выбора для доказательства присутствия на эритроцитах связанных антител.
Механизмы иммунного гемолиза. Выделяют три основных иммунных механизма, которые в конечном счете приводят к лизису эритроцитов:
- модификация эритроцитарных антигенов и выработка соответствующих антител;
- выработка полных аутоантител, способных вступить в реакцию с аутологичными эритроцитарными антигенами;
- элиминация эритроцитов в результате неспецифической адсорбции антител.
Как уже было отмечено, тепловые аутоантитела способны реагировать с эритроцитами собственного организма. Положительный непрямой АГТ с использованием сыворотки анти-IgG подтверждает факт их связывания на поверхности эритроцитов. Процесс клеточной деструкции при гемолитических заболеваниях в целом очень сложен. Согласно Leddy и соавт., наиболее важны следующие факторы:
- определенное соотношение между количеством связанных антител и эритроцитов (с учетом аффинности первых); минимальный показатель составляет 20 молекул на 1 клетку;
- способность антител к связыванию комплемента.
Предполагают, что окончательно к разрушению эритроцитов приводят следующие механизмы: а) комплементзависимый гемолиз), б) образование эритроцитарного секвестра и фагоцитоз эритроцитов. Многочисленные данные указывают на сочетание этих процессов.
Комплементзависимый гемолиз. Связывание и активация комплемента обусловливают дисфункцию клеточной мембраны. В принципе возможны два типа дефектов:
- не очень крупные (до 3,2 нм), при которых нарушается осмотическое равновесие с последующим прободением мембраны и пассажем молекул белка; одновременно отмечают морфологические изменения клеточной структуры;
- крупные, сопровождаемые явными признаками клеточной деструкции.
Существует определенная зависимость и от класса lg; сходный эффект достигается при связывании комплемента с одной молекулой IgM или примерно с 800 молекулами IgG. Обычно внутрисосудистый гемолиз проявляется при условии, если на эритроците связываются 1000 молекул С3.
Распределение мембранных антигенов на поверхности эритроцита, размер и мобильность мозаично расположенных антигенных структур также определяют характер гемолиза. У больных с приобретенной гемолитической анемией диаметр дефекта составляет 3 нм, а при действии А-антигена обнаруживают 24-кратное увеличение этого показателя. Особенностью антигенной структуры объясняют предрасположенность к гемолизу больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией (вероятно, с неспецифической активацией комплемента). Кроме того, определенная топография Rh-антигенов препятствует активации комплемента (реакция с IgM). К выраженному внутрисосудистому гемолизу с гемоглобинемией приводит значительное содержание антител, способных к активации комплемента. При других клинических формах преобладает внесосудистый распад клеток.
Цитолиз не всегда вызывается только с помощью фиксированных на эритроцитах антител (без участия комплемента и других клеток), тем не менее доказан целый ряд изменений внутриклеточного обмена, например снижение уровня АТФ и гликолиза, а также повышенная активность АТФазы.
Образование эритроцитарного секвестра, очевидно, происходит под воздействием тепловых аутоантител и иммунного гемолиза, обусловленного приемом медикаментов. При этом наблюдают отделение и фильтрацию клеток из кровеносного русла и их лизис.
Хотя клеточный распад возможен в костном мозге, основные процессы развиваются в печени и селезенке. Способность этих органов к элиминации эритроцитов предотвращает в дальнейшем кризы внутрисосудистого гемолиза.
Исследования показали, что в печени в основном сосредоточены эритроциты, которые несут антитела и комплемент (С3b), в селезенке - только клетки, нагруженные IgG. Считают, что при отделении эритроцитов определенное значение имеют IgG-структуры и рецепторы для С3b на тканевых макрофагах. С этой концепцией согласуются данные, что образование антиэритроцитарных антител IgG2 и IgG4 субклассов не сопровождается выраженным гемолизом.
Остается открытым вопрос о самом механизме распада. Вероятно, значительную роль играют нарушения, обусловленные фагоцитозом эритроцитов; это относится по крайней мере к клеткам, нагруженным IgG. Эритроциты, связанные на макрофагах, изменяют форму, постепенно снижается их резистентность, нарастают осмотические сдвиги вплоть до окончательного цитолиза. Скорость элиминации зависит от степени сенсибилизации С3b или IgG, концентрации антител и их аффинности, а также от других факторов, связанных с активацией комплемента (в том числе от поверхностных детерминант). Действием С3b-инактиватора можно объяснить тот факт, что отфильтрованные в органах эритроциты вновь попадают в циркуляцию. Нарушая связи С3b-С3с, этот фактор приводит к необратимым изменениям, в результате чего на эритроцитах остается только компонент С3, для которого отсутствуют рецепторы на макрофагах. Этот эффект наблюдают прежде всего при относительно медленной и слабовыраженной фиксации холодовых антител.
Процессы распада сопровождаются характерным сфероцитозом (за исключением врожденного дефекта эритроцитов). Его нельзя воспроизвести in vitro только с помощью сыворотки, содержащей специфические антитела, так как необходима одновременная инкубация с моноцитами и макрофагами. В результате часть клеток разрушается, а другая подвергается лизису вследствие повреждения мембраны. В настоящее время получены данные, свидетельствующие о проявлении реакции АЗКД (К-клетки), а также участков других мононуклеаров.
Наряду с активными процессами отмечают чисто механическую фильтрацию. Ультраструктурный анализ наглядно показал, что образование шипов на клеточной поверхности эритроцитов способствует их агрегации.
Фагоцитоз эритроцитов. Патогенетическое значение данного феномена еще не вполне ясно, хотя его постоянно наблюдают при аутоиммунной гемолитической анемии, особенно при состояниях, обусловленных активностью тепловых аутоантител и Rh-сенсибилизацией. Проба на фагоцитоз включает инкубацию образца крови с антикоагулянтом при 37°С в течение определенного периода времени.
Начиная с первых опытов P. Erlich, фагоцитоз эритроцитов регулярно обнаруживают у больных пароксизмальной холодовой гемоглобинурией. Сравнительно часто это явление встречается в случаях заболевания лимфоидных органов, особенно при лимфогранулематозе. Наряду с иммунными факторами (титр и свойства антител) решающее значение может иметь активность самих фагоцитов. Этим объясняются наблюдения, что у части больных с отрицательным АГТ выявляют выраженный гемолиз, а у других, несмотря на положительную реакцию, признаки гемолиза отсутствуют. И наконец, гемолитические кризы, в частности, вызванные инфекцией, объясняют также активацией макрофагов.
Читать далее Лечение аутоиммунной гемолитической анемии
Антитела другого вида, ответственные за аутоиммунные гемолитические процессы, обладают особыми свойствами: они не способны непосредственно вызывать агглютинацию или гемолиз. Ввиду их моноклональности они были обозначены как «неполные антитела», однако условием определения активности антител класса IgG является двухвалентность. При объяснении эффекта моноклональных антител исходят из следующих представлений:
1. Наличие одного участка связывания с антигеном, что ограничивает функциональную активность антител. С помощью макромолекулярных веществ, ферментов, а также антиглобулиновой сыворотки можно воссоздать 2-й участок связывания с антигеном, изменить и восстановить пространственную структуру антител в соответствии с конфигурацией молекулы IgG.
2. Определенное структурное соотношение в системе антиген - антитело. По-видимому, локализация антигена такова, что малая молекула IgG не может обеспечить связывания между двумя эритроцитами. Обработка эритроцитов протеолитическим ферментом может привести к изменению пространственного соотношения, что способствует агглютинации.
3. Влияние поверхностного заряда. Известно, что активность антител вызывает снижение поверхностного заряда эритроцитов. Под воздействием неполных антител этот эффект оказывается недостаточным для реакции агглютинации. Положительный результат возможен при изменении ионной силы, добавлении макромолекул и т. д.
Фактически ни одна из этих теорий не объясняет в полной мере данного феномена. Вывод о выработке моновалентных структур нельзя делать на основании прямой реакции агглютинации, для этого необходимы соответствующие модификации.
Антиглобулиновый тест. С помощью прямого АГТ удалось установить, что, как правило, именно антитела связываются на поверхности эритроцитов. Путем элюции (нагревание, окисление) их можно выделить и перенести на другие клетки, однако детальные исследования показали, что это не всегда объясняется связыванием аутоантител; в реакции участвуют и компоненты комплемента, особенно С3 и С4 (сублитическое связывание комплемента). В опытах были определены три способа сенсибилизации эритроцитов:
- IgG и комплементом (45-60%),
- IgG (30-45%),
- комплементом (5-17%).
В первом случае связывание компонентов комплемента происходит в результате фиксации антител на эритроцитах. Остается неясным, почему эта реакция возможна без участия комплемента. Было показано, что это обусловлено специфичностью антител к определенному антигену. Известную роль, по-видимому, играет также пространственная структура антител, так как полагают, что для связывания комплемента необходимы две близко расположенные молекулы IgG. К примеру, Rh-детерминанты находятся слишком далеко друг от друга. Процесс связывания на эритроцитах исключительно одних компонентов комплемента характерен для болезни холодовых агглютининов, при холодовой гемоглобинурии и гемолитических анемиях, вызванных приемом лекарственных препаратов. При нормальной температуре холодовые антитела не связаны с антигеном. Все же достаточно чувствительные методы позволили выявить lg и при сенсибилизации эритроцитов комплементом. В остальных случаях предполагают, что эритроциты, нагруженные комплементом, появляются в результате потери антител при отмывании, фиксации комплемента путем обратной связи с комплексом антиген - антитело, а также вследствие неиммунной природы связывания комплемента. Указанные типы сенсибилизации эритроцитов характерны и для вторичных форм аутоиммунной гемолитической анемии. Так, при системной красной волчанке обнаруживают эритроциты 1-го и 3-го типов, во время активного гемолиза - прежде всего 1-го типа.
С помощью соответствующих модификаций можно идентифицировать класс и вид антител, например при использовании моноспецифических меченых антисывороток.
Положительный прямой АГТ при явных признаках гемолиза позволяет подтвердить диагноз гемолитической анемии, вызванной тепловыми аутоантителами. Иногда это характерно для случаев аутоиммунной анемии, обусловленных лекарственный терапией, и очень редко положительный прямой АГТ встречается у здоровых лиц. Доказательство селективного связывания комплемента на эритроцитах, полученное с помощью сыворотки анти-С3, свидетельствует скорее всего об активности холодовых антител. Обычно в этом убеждаются, когда у больных безуспешно пытаются отделить сыворотку и эритроциты при 37 °С. Антикомплементарный тест может оказаться положительным примерно у 8% больных, у которых гемолиз клинически не проявляется.
АГТ не служит показателем тяжести заболевания или средством терапевтического контроля. Кроме реакции связывания С3-компонента комплемента и определения уровня антител, используют полуколичественный метод, при котором эритроциты инкубируют с разными разведениями антисыворотки против lg человека.
Результаты РСК на эритроцитах позволили объяснить наблюдение, что уровень комплемента в сыворотке часто снижен, хотя и реже, чем при аутоиммунной гемолитической анемии, обусловленной Холодовыми агглютининами. Наряду с данными о снижении общей гемолитической активности сообщалось о случаях преимущественного дефицита С3.
Несвязанные антитела. Помимо антител, фиксированных на клетках и выявляемых в прямом АГТ, в 50-60% наблюдений описаны несвязанные аутоантитела. Они были продемонстрированы с помощью непрямого АГТ. О свойствах аутоантител судят по их способности вступать в реакцию с аутологичными клетками. Для этой цели эритроциты больного не всегда пригодны: наличие эритроцитов, нагруженных аутоантителами и комплементом, создает дополнительные сложности в работе.
При выявлении несвязанных антител определенную ценность имеет информация о специфичности связанных антител, которую можно получить путем анализа эритроцитов больного. Так, если показана анти-С-специфичность, то для выявления несвязанных антител используют С+-эритроциты. Обработка тест-эритроцитов ферментом значительно повышает чувствительность метода. Различие в специфичности свободных и связанных антител свидетельствует о том, что мы имеем дело с присутствием аллоантител. Значение несвязанных аутоантител еще неясно. Связывание их на поверхности эритроцитов - это динамический, обратимый процесс, поэтому часть антител остается в сыворотке в свободном состоянии. Их титр зависит как от количества молекул, так и от аффинности последних к рецепторам на эритроцитах.
Наряду с этим выявляют антитела, реагирующие только с эритроцитами, обработанными ферментом, обычно они относятся к классу IgM. Их роль также не вполне ясна. Для идентификации антител, имеющих патогенетическое значение и реагирующих с собственными эритроцитами, в первую очередь проводят анализ элюатов, снимаемых с эритроцитов. Безусловно, не следует допускать, чтобы по недосмотру были элюированы и неспецифически адсорбированные белки. В частности, известен так называемый Ogata-феномен, когда при специфической реакции антиэритроцитарных антител с соответствующим антигеном происходило связывание антител другой специфичности.
Температура, рН и другие факторы. При некотором окислении среды можно добиться усиления реакции агглютинации и гемолиза. Оптимальны условия при рН 6,5-7,0 и нормальной температуре организма, однако были описаны единичные случаи, когда эффект наблюдали при 40 °С или 10-20 °С. Установлено, что гепарин подавляет реакцию агглютинации, а положительный АГТ после его добавления становится отрицательным. Результаты этих опытов позволили объяснить известные терапевтические эффекты. Хотя точные механизмы данного явления еще не раскрыты, предполагают, что определенную роль играют реакции гепарина с С3-компонентом комплемента. Кроме того, не исключено его влияние на аутоантитела или их реакцию с поверхностными антигенами эритроцитов.
Антиген. Тот факт, что тепловые аутоантитела реагируют с большим количеством эритроцитов, долгое время объясняли проявлением неспецифических реакций. В исследованиях с применением эритроцитов разных групп крови человека при титровании сывороток имеют место значительные количественные различия. В 30-40% (первичные формы и комбинация с В-клеточной пролиферацией) отмечена Rh-специфичность. Так, были обнаружены антитела к антигенам системы резус, например, анти-е, анти-с и анти-d. В большинстве случаев изучаемые специфичности не точно соответствовали Rh-изоантителам.
Следует различать аллоантитела сходной специфичности. Два первых типа антител, очевидно, направлены против главной структуры или исходного вещества антигена Rh. С этой точки зрения становится понятным феномен положительной реакции антител человека с эритроцитами некоторых видов человекообразных обезьян. Продукция антител может быть вызвана и перекрестно реагирующими антигенами. Существуют разные номенклатуры антигенов резус, основанные, в частности, на генетических взаимоотношениях антигенов этой системы.
Изменения в картине костного мозга. Развитие гипоплазии пытались объяснить действием факторов, повреждающих костный мозг, однако в подавляющем большинстве исследований было показано, что антиэритроцитарные аутоантитела обладают способностью реагировать с ядросодержащими предшественниками эритроцитов, включая эритробласты. Поскольку в системе кровь - костный мозг отсутствует какой-либо барьер, то из этого следует, что антитела могут оказывать цитотоксическое действие на клетки костного мозга. Выраженность его зависит главным образом от титра и аффинности аутоантител. При выработке низкоаффинных антител и в невысоком титре в картине костного мозга, как правило, преобладает стимуляция. Напротив, при значительных титрах и/или высокой аффинности антител может проявляться их цитотоксический эффект, что соответствует нарастанию признаков аплазии костного мозга. Эти данные были с достаточной очевидностью продемонстрированы на экспериментальных животных. По-видимому, сходные механизмы действуют главным образом при хронически прогредиентном течении заболевания. Различие острых апластических кризов, вероятно, обусловлено влиянием дополнительных токсических факторов (инфекция, медикаменты и др.).
Панцитопения. Этиология некоторых форм изучена не полностью. В качестве одной из причин называют активацию моноцитарно-макрофагальной системы. Другое представление связано с наблюдением, что антигены групп крови присутствуют также на тромбоцитах и лейкоцитах. И наконец, панцитопения может развиться в результате нарушений механизмов иммунорегуляции, что приводит к выработке аутоантител к лейкоцитам или тромбоцитам. Таким образом, становится понятным утверждение некоторых авторов, что аутоиммунная гемолитическая анемия и идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП) - это лишь два разных проявления одного иммунного дефекта. Действительно, при ИТП антиглобулиновый тест сравнительно часто оказывается положительным, а в ряде клинических случаев развивается выраженная анемия.
Определение тепловых аутоантител. В целом антиэритроцитарные тепловые аутоантитела являются неполными, только в редких случаях они вызывают агглютинацию в солевой среде, поэтому для их обнаружения необходимы особые методы. В клинических лабораториях используют в основном антиглобулиновый тест, метод с добавлением коллоидных макромолекулярных веществ, а также технику обработки ферментами.
Дополнительные реакции. Еще в 1945 г. было впервые показано, что добавление раствора альбумина к суспензии эритроцитов, нагруженных неполными тепловыми аутоантителами, приводит к агглютинации. Эта реакция получила название «конглютинация». В последние годы для этой цели были предложены также декстран, поливинилпирролидон (ПВП) и карбоксиметилцеллюлоза. Наиболее результативным оказался метод с ПВП.
Антиглобулиновый тест впервые разработали Coombs и соавт. Принцип пробы Кумбса состоит в том, что на эритроцитах фиксируются моновалентные антитела, которые с помощью антиглобулиновой сыворотки могут воссоединиться в полные двухвалентные антитела. Наряду с прямым АГТ для выявления неполных антител был предложен и непрямой вариант, при котором исследуемую сыворотку инкубируют с эритроцитами и непосредственно после этого добавляют антиглобулиновую сыворотку. Обычно иммунную антисыворотку против глобулинов человека получают от кроликов и коз. Для иммунизации животных используют как глобулииовую фракцию нормальной сыворотки, так и образцы сывороток, содержащих аутоантитела. Наряду с этими «антисыворотками широкого спектра» можно применять и моноспецифические антисыворотки или моноклональные Ат к отдельным классам lg.
В отличие от дополнительных методов основу АГТ составляет специфическая иммунная реакция. Тем не менее ряд данных указывает на ее недостаточную надежность:
- антиглобулиновые сыворотки проявляют достаточную вариабельность в зависимости от титра, аффинности и т. д.;
- прямой АГТ оказывается положительным лишь тогда, когда минимум 400 молекул антител связываются на поверхности эритроцита.
Поскольку активный цитолиз возможен уже при фиксации примерно 20 молекул, то неудивительно, что в определенном проценте случаев АГТ не воспроизводится. Более чувствительна модификация метода, при которой титр антител определяют с помощью РСК (тест потребления антител при связывании комплемента). От разной степени «нагрузки» эритроцитов не всегда зависят показатели по крайней мере прямого АГТ. Между тем избыток антител или антигена может привести к ложноотрицательным результатам, поэтому исследование проводят с различными разведениями сыворотки.
Вопреки прежним представлениям удалось показать, что lg могут неспецифически адсорбироваться на поверхности эритроцитов и полностью не удаляются даже после неоднократного отмывания клеток. Агглютинацию же вызывает реакция антиглобулиновой фракции только со специфически связанными lg. Еще не вполне ясно, какова роль пространственных структурных различий между специфически и неспецифически связанными lg. Ответ на этот вопрос имеет практическое значение, так как позволяет судить о специфичности АГТ.
Обработка эритроцитов протеолитическими ферментами. Протеолитические ферменты холерного вибриона способствуют реакции агглютинации с неполными антителами. Подобное действие на эритроциты оказывает трипсин, в большинстве случаев для этой цели используют папаин и бромелин. Начальный этап реакции - получение папаинизированных эритроцитов. Последующая инкубация этих эритроцитов с сыворотками, содержащими неполные антитела, приводит к четко выраженной агглютинации. Сходные результаты получают и при активации бромелином, который представляет собой смесь протеолитических ферментов; это довольно чувствительный тест, поскольку реакция происходит в течение 15 мин при комнатной температуре. Методы с использованием фицина (энзим из растений семейства фиговых) и проназы распространены относительно меньше. Еще не вполне ясен механизм, лежащий в основе агглютинации неполных антител. Наиболее вероятны следующие предположения:
- протеолитические ферменты как бы обнажают поверхностную структуру антигена таким образом, что значительное количество антител может фиксироваться на клеточной поверхности;
- обработка эритроцитов приводит к такому изменению конфигурации неполных антител, что они приобретают свойства двухвалентных антител. Один из вариантов этой теории: изменение клеточной поверхности способствует реакции между близко расположенными эритроцитами;
- в процессе обработки ферментом с поверхности эритроцитов отщепляется N-ацетилнейраминовая кислота. Это сопровождается уменьшением межклеточных сил отталкивания, что способствует агглютинации.
Не исключено, что указанные факторы действуют как синергисты. Полученные результаты следует интерпретировать с определенной предосторожностью, так как у некоторых здоровых лиц выявляют антитела, реагирующие с эритроцитами, обработанными протеазой, разумеется, в очень низком титре.
Ложноотрицательные реакции наблюдают в тех случаях, когда соответствующие антигены, например М и N, подвергаются разрушению. Считают, что этот эффект не имеет практического значения при выявлении тепловых аутоантител.
Указанные методы не аналогичны и поэтому лишь условно сопоставимы. Наиболее воспроизводимыми и информативными считаются тесты с использованием антиглобулиновой сыворотки и ферментов. Целесообразно воспроизводить по крайней мере два разных метода, так как отрицательные результаты реакции не всегда свидетельствуют об отсутствии соответствующих антител. Прямой АГТ служит прежде всего методом выбора для доказательства присутствия на эритроцитах связанных антител.
Механизмы иммунного гемолиза. Выделяют три основных иммунных механизма, которые в конечном счете приводят к лизису эритроцитов:
- модификация эритроцитарных антигенов и выработка соответствующих антител;
- выработка полных аутоантител, способных вступить в реакцию с аутологичными эритроцитарными антигенами;
- элиминация эритроцитов в результате неспецифической адсорбции антител.
Как уже было отмечено, тепловые аутоантитела способны реагировать с эритроцитами собственного организма. Положительный непрямой АГТ с использованием сыворотки анти-IgG подтверждает факт их связывания на поверхности эритроцитов. Процесс клеточной деструкции при гемолитических заболеваниях в целом очень сложен. Согласно Leddy и соавт., наиболее важны следующие факторы:
- определенное соотношение между количеством связанных антител и эритроцитов (с учетом аффинности первых); минимальный показатель составляет 20 молекул на 1 клетку;
- способность антител к связыванию комплемента.
Предполагают, что окончательно к разрушению эритроцитов приводят следующие механизмы: а) комплементзависимый гемолиз), б) образование эритроцитарного секвестра и фагоцитоз эритроцитов. Многочисленные данные указывают на сочетание этих процессов.
Комплементзависимый гемолиз. Связывание и активация комплемента обусловливают дисфункцию клеточной мембраны. В принципе возможны два типа дефектов:
- не очень крупные (до 3,2 нм), при которых нарушается осмотическое равновесие с последующим прободением мембраны и пассажем молекул белка; одновременно отмечают морфологические изменения клеточной структуры;
- крупные, сопровождаемые явными признаками клеточной деструкции.
Существует определенная зависимость и от класса lg; сходный эффект достигается при связывании комплемента с одной молекулой IgM или примерно с 800 молекулами IgG. Обычно внутрисосудистый гемолиз проявляется при условии, если на эритроците связываются 1000 молекул С3.
Распределение мембранных антигенов на поверхности эритроцита, размер и мобильность мозаично расположенных антигенных структур также определяют характер гемолиза. У больных с приобретенной гемолитической анемией диаметр дефекта составляет 3 нм, а при действии А-антигена обнаруживают 24-кратное увеличение этого показателя. Особенностью антигенной структуры объясняют предрасположенность к гемолизу больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией (вероятно, с неспецифической активацией комплемента). Кроме того, определенная топография Rh-антигенов препятствует активации комплемента (реакция с IgM). К выраженному внутрисосудистому гемолизу с гемоглобинемией приводит значительное содержание антител, способных к активации комплемента. При других клинических формах преобладает внесосудистый распад клеток.
Цитолиз не всегда вызывается только с помощью фиксированных на эритроцитах антител (без участия комплемента и других клеток), тем не менее доказан целый ряд изменений внутриклеточного обмена, например снижение уровня АТФ и гликолиза, а также повышенная активность АТФазы.
Образование эритроцитарного секвестра, очевидно, происходит под воздействием тепловых аутоантител и иммунного гемолиза, обусловленного приемом медикаментов. При этом наблюдают отделение и фильтрацию клеток из кровеносного русла и их лизис.
Хотя клеточный распад возможен в костном мозге, основные процессы развиваются в печени и селезенке. Способность этих органов к элиминации эритроцитов предотвращает в дальнейшем кризы внутрисосудистого гемолиза.
Исследования показали, что в печени в основном сосредоточены эритроциты, которые несут антитела и комплемент (С3b), в селезенке - только клетки, нагруженные IgG. Считают, что при отделении эритроцитов определенное значение имеют IgG-структуры и рецепторы для С3b на тканевых макрофагах. С этой концепцией согласуются данные, что образование антиэритроцитарных антител IgG2 и IgG4 субклассов не сопровождается выраженным гемолизом.
Остается открытым вопрос о самом механизме распада. Вероятно, значительную роль играют нарушения, обусловленные фагоцитозом эритроцитов; это относится по крайней мере к клеткам, нагруженным IgG. Эритроциты, связанные на макрофагах, изменяют форму, постепенно снижается их резистентность, нарастают осмотические сдвиги вплоть до окончательного цитолиза. Скорость элиминации зависит от степени сенсибилизации С3b или IgG, концентрации антител и их аффинности, а также от других факторов, связанных с активацией комплемента (в том числе от поверхностных детерминант). Действием С3b-инактиватора можно объяснить тот факт, что отфильтрованные в органах эритроциты вновь попадают в циркуляцию. Нарушая связи С3b-С3с, этот фактор приводит к необратимым изменениям, в результате чего на эритроцитах остается только компонент С3, для которого отсутствуют рецепторы на макрофагах. Этот эффект наблюдают прежде всего при относительно медленной и слабовыраженной фиксации холодовых антител.
Процессы распада сопровождаются характерным сфероцитозом (за исключением врожденного дефекта эритроцитов). Его нельзя воспроизвести in vitro только с помощью сыворотки, содержащей специфические антитела, так как необходима одновременная инкубация с моноцитами и макрофагами. В результате часть клеток разрушается, а другая подвергается лизису вследствие повреждения мембраны. В настоящее время получены данные, свидетельствующие о проявлении реакции АЗКД (К-клетки), а также участков других мононуклеаров.
Наряду с активными процессами отмечают чисто механическую фильтрацию. Ультраструктурный анализ наглядно показал, что образование шипов на клеточной поверхности эритроцитов способствует их агрегации.
Фагоцитоз эритроцитов. Патогенетическое значение данного феномена еще не вполне ясно, хотя его постоянно наблюдают при аутоиммунной гемолитической анемии, особенно при состояниях, обусловленных активностью тепловых аутоантител и Rh-сенсибилизацией. Проба на фагоцитоз включает инкубацию образца крови с антикоагулянтом при 37°С в течение определенного периода времени.
Начиная с первых опытов P. Erlich, фагоцитоз эритроцитов регулярно обнаруживают у больных пароксизмальной холодовой гемоглобинурией. Сравнительно часто это явление встречается в случаях заболевания лимфоидных органов, особенно при лимфогранулематозе. Наряду с иммунными факторами (титр и свойства антител) решающее значение может иметь активность самих фагоцитов. Этим объясняются наблюдения, что у части больных с отрицательным АГТ выявляют выраженный гемолиз, а у других, несмотря на положительную реакцию, признаки гемолиза отсутствуют. И наконец, гемолитические кризы, в частности, вызванные инфекцией, объясняют также активацией макрофагов.
Читать далее Лечение аутоиммунной гемолитической анемии