Методы выявления антител при бесплодии
При бесплодии был выявлен ряд антител, обладающих разными свойствами. Особое значение для определения их уровня приобрели методы агглютинации, в том числе микротест по Friberg, иммобилизации, а также техника иммунофлюоресценции, ELISA.
Тест агглютинации спермиев. Этот метод довольно чувствителен. Известны две модификации теста.
Макроскопический тест спермоагглютинации по Kibrick. Пробу эякулята отстаивают при комнатной температуре в течение 1 ч, осажденные клетки разводят 0,9% раствором NaCl до концентрации 40 млн/мл и смешивают в соотношении 1:1 с 10% раствором желатины (0,9% NaCl).
Для проведения реакции к 0,3 мл сыворотки больного или ее разведений добавляют равный объем эякулята, приготовленного на растворе желатины. Смесь реагентов инкубируют в течение 2 ч при 37 °С в пробирках с закрытой пробкой. В качестве контроля используют образцы тест-отрицательной и тест-положительной сывороток. Результаты учитывают на основании следующих критериев:
- гомогенная суспензия клеток (отрицательная реакция);
- хорошо различимые фракции: осадок, хлопьевидный агглютинат и прозрачный супернатант (положительная реакция).
Микроскопический тест спермоагглютинации по Friberg. В качестве носителя служит микроплата из синтетического материала. Тест-сыворотку последовательно разводят с помощью забуференного физиологического раствора. Далее 5 мкл каждого из разведений сыворотки вносят с помощью микрошприца в углубление микроплат и покрывают слоем жидкого парафинового масла. Учет результатов реакции производят либо через 4 ч инкубации при комнатной температуре, либо через 2 ч инкубации при 37 °С. Проба сыворотки считается положительной, если по крайней мере при двукратном разведении обнаруживают четкие агглютинаты.
Полагают, что наиболее целесообразно для получения высокомобильных спермиев использовать технику «suim-up». Пробу эякулята, обогащенную спермиями, центрифугируют при 400-750 g в течение 10 мин. Супернатант удаляют, а к осадку добавляют 0,5 мл PBS или культуральной среды. Через 60 мин инкубации при 37 °С в супернатанте концентрируются спермии, обладающие высокой подвижностью, которые разводят до концентрации 40 млн/мл.
Тест иммобилизации спермиев по Isojima и Lehrnann. Пробу эякулята разводят до концентрации 60 млн/мл. Тест-реагентами служат 0,25 мл инактивированной сыворотки больного (30 мин при 50 °С), 0,025 мл суспензии эякулята и 0,0025 мл комплемента. В качестве контроля используют тест-систему без добавления комплемента. Для контроля комплемента исследуемую сыворотку заменяют 0,25 мл 0,9% раствора NaCl. Смесь реагентов инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Образующийся осадок ресуспендируют, после чего производят учет реакции с помощью фазово-контрастного микроскопа. Критерием положительной реакции служит индекс иммобилизации (соотношение показателей подвижности клеток в контроле и опыте). Тест считается положительным, если спермии утрачивают свои мобильные свойства по крайней мере на 50%. Если сыворотки обладают подобной активностью, следует определить их титр.
Методы непрямой иммунофлюоресценции по Coons и Kaplan. Предварительно отмытые клетки исследуемого эякулята наносят на предметное стекло в виде мазка и фиксируют ацетоном. Затем препарат обрабатывают сывороткой обследуемого лица (например, в разведении 1:5) и инкубируют во влажной камере при 37 °С в течение 30 мин. После тщательного отмывания исследуемую пробу обрабатывают антисывороткой к глобулину человека, меченной флюоресцеином. Смесь реагентов вновь инкубируют в течение 30 мин. Результаты реакции учитывают с помощью флюоресцентной микроскопии. При этом свечение может локализоваться в акросоме, постакросомной части головы, области хвоста или промежуточных участках спермия. Для объективной оценки результатов необходима постановка соответствующих контролей.
Прочие методы определения антиспермальных антител. Особое значение приобрел MAR-тест, предложенный Coombs и впоследствии разработанный Jager. Прямой вариант теста состоит в определении антител на поверхности мужских половых клеток, а непрямой - сывороточных антител. IgG- или IgA-сенсибилизированные эритроциты смешивают с моноспецифическими анти-IgG или анти-IgA и тестируемыми спермиями. Учитывают процент тех спермиев, которые образуют агглютинаты, связанные на поверхности эритроцитов. При постановке непрямого теста используют в качестве реагентов нормальные спермии и тестируемую сыворотку. Immunobead-тест (на бусинках, гранулах) позволяет учитывать Ig разных классов: индикаторные частицы из полиакриламида (d=5-10 мкм) нагружаются ковалентно связанными анти-IgG, анти-IgM, анти-IgA и используются, как и в MAR-тесте, для прямого и непрямого варианта определения антиспермальных антител.
Тест агглютинации спермиев. Этот метод довольно чувствителен. Известны две модификации теста.
Макроскопический тест спермоагглютинации по Kibrick. Пробу эякулята отстаивают при комнатной температуре в течение 1 ч, осажденные клетки разводят 0,9% раствором NaCl до концентрации 40 млн/мл и смешивают в соотношении 1:1 с 10% раствором желатины (0,9% NaCl).
Для проведения реакции к 0,3 мл сыворотки больного или ее разведений добавляют равный объем эякулята, приготовленного на растворе желатины. Смесь реагентов инкубируют в течение 2 ч при 37 °С в пробирках с закрытой пробкой. В качестве контроля используют образцы тест-отрицательной и тест-положительной сывороток. Результаты учитывают на основании следующих критериев:
- гомогенная суспензия клеток (отрицательная реакция);
- хорошо различимые фракции: осадок, хлопьевидный агглютинат и прозрачный супернатант (положительная реакция).
Микроскопический тест спермоагглютинации по Friberg. В качестве носителя служит микроплата из синтетического материала. Тест-сыворотку последовательно разводят с помощью забуференного физиологического раствора. Далее 5 мкл каждого из разведений сыворотки вносят с помощью микрошприца в углубление микроплат и покрывают слоем жидкого парафинового масла. Учет результатов реакции производят либо через 4 ч инкубации при комнатной температуре, либо через 2 ч инкубации при 37 °С. Проба сыворотки считается положительной, если по крайней мере при двукратном разведении обнаруживают четкие агглютинаты.
Полагают, что наиболее целесообразно для получения высокомобильных спермиев использовать технику «suim-up». Пробу эякулята, обогащенную спермиями, центрифугируют при 400-750 g в течение 10 мин. Супернатант удаляют, а к осадку добавляют 0,5 мл PBS или культуральной среды. Через 60 мин инкубации при 37 °С в супернатанте концентрируются спермии, обладающие высокой подвижностью, которые разводят до концентрации 40 млн/мл.
Тест иммобилизации спермиев по Isojima и Lehrnann. Пробу эякулята разводят до концентрации 60 млн/мл. Тест-реагентами служат 0,25 мл инактивированной сыворотки больного (30 мин при 50 °С), 0,025 мл суспензии эякулята и 0,0025 мл комплемента. В качестве контроля используют тест-систему без добавления комплемента. Для контроля комплемента исследуемую сыворотку заменяют 0,25 мл 0,9% раствора NaCl. Смесь реагентов инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Образующийся осадок ресуспендируют, после чего производят учет реакции с помощью фазово-контрастного микроскопа. Критерием положительной реакции служит индекс иммобилизации (соотношение показателей подвижности клеток в контроле и опыте). Тест считается положительным, если спермии утрачивают свои мобильные свойства по крайней мере на 50%. Если сыворотки обладают подобной активностью, следует определить их титр.
Методы непрямой иммунофлюоресценции по Coons и Kaplan. Предварительно отмытые клетки исследуемого эякулята наносят на предметное стекло в виде мазка и фиксируют ацетоном. Затем препарат обрабатывают сывороткой обследуемого лица (например, в разведении 1:5) и инкубируют во влажной камере при 37 °С в течение 30 мин. После тщательного отмывания исследуемую пробу обрабатывают антисывороткой к глобулину человека, меченной флюоресцеином. Смесь реагентов вновь инкубируют в течение 30 мин. Результаты реакции учитывают с помощью флюоресцентной микроскопии. При этом свечение может локализоваться в акросоме, постакросомной части головы, области хвоста или промежуточных участках спермия. Для объективной оценки результатов необходима постановка соответствующих контролей.
Прочие методы определения антиспермальных антител. Особое значение приобрел MAR-тест, предложенный Coombs и впоследствии разработанный Jager. Прямой вариант теста состоит в определении антител на поверхности мужских половых клеток, а непрямой - сывороточных антител. IgG- или IgA-сенсибилизированные эритроциты смешивают с моноспецифическими анти-IgG или анти-IgA и тестируемыми спермиями. Учитывают процент тех спермиев, которые образуют агглютинаты, связанные на поверхности эритроцитов. При постановке непрямого теста используют в качестве реагентов нормальные спермии и тестируемую сыворотку. Immunobead-тест (на бусинках, гранулах) позволяет учитывать Ig разных классов: индикаторные частицы из полиакриламида (d=5-10 мкм) нагружаются ковалентно связанными анти-IgG, анти-IgM, анти-IgA и используются, как и в MAR-тесте, для прямого и непрямого варианта определения антиспермальных антител.