Вакцина АКДС
Эта ассоциированная вакцина состоит из смеси убитой корпускулярной коклюшной вакцины с дифтерийным и столбнячным анатоксинами и применяется для профилактики коклюша, дифтерии и столбняка. Так как при необходимости компоненты этой сложной вакцины могут использоваться в виде самостоятельных средств иммунопрофилактики либо в разных сочетаниях, как, например, смесь двух анатоксинов, оправдано раздельное рассмотрение принципов изготовления и применения каждого компонента, входящего в состав АКДС-вакцины.
Дифтерийный анатоксин. Возможность обезвреживания (детоксикации) дифтерийного токсина под действием формалина была установлена Сальковским еще в 1898 г. Затем Левенштейн и Эйслер в 1912 г. обнаружили, что обработанный формалином токсин утрачивает токсичность, сохраняя при этом высокую иммуногенную активность, так как его безболезненное введение экспериментальным животным сообщало состояние устойчивости к последующим инъекциям заведомо смертельных доз необезвреженного, так называемого нативного, токсина. Однако изготовление препарата, пригодного для иммунизации людей, по праву связывают с именем французского исследователя Г. Рамона, который разработал основы технологии производства и стандартизации дифтерийного и столбнячного анатоксинов с помощью специальных методов оценки их активности, что определило возможность выбора оптимальных прививочных дозировок и рациональной схемы вакцинации. Работы Г. Рамона позволили начать массовое изготовление и применение дифтерийного и столбнячного анатоксинов, что за сравнительно короткий период времени привело к резкому снижению заболеваемости дифтерией и столбняком во многих странах мира.
Начальным этапом технологии производства дифтерийного анатоксина является получение токсина дифтерийных микробов. В течение многих лет в качестве культуры микробов - продуцентов токсина используют выделенный в 1894 г. двумя исследователями и названный в их честь штамм Паркс-Вильямс-8 (PW-8), или, вернее, его разные варианты, адаптированные к разным условиям культивирования, принятым в той или иной стране. Так, в нашей стране используют вариант Массачусетс.
Для получения большого количества токсина подготовленную особым образом посевную культуру этих микробов засевают на жидкие питательные среды, содержащиеся в алюминиевых котлах - реакторах вместимостью до 80 л и более. При условии постоянного перемешивания и аэрирования стерильным воздухом рост микробов и продуцирование ими токсина осуществляется в таком реакторе особенно интенсивно. После 36-40 ч выращивания при 34-35°С содержимое реактора обрабатывается в суперцентрифугах для отделения раствора токсина от микробной массы. Затем токсин стерилизуют путем фильтрации и помещают в специальные реакторы или большие бутыли для частичной детоксикации. С этой целью к постоянно перемешиваемому токсину добавляют 0,6% формалина и выдерживают до 5 суток при 30-40°С. После этого частично обезвреженный токсин осаждают в основном с помощью трихлоруксусной кислоты, растворяют, очищают, стерилизуют фильтрацией, пропуская через фильтрующе-стерилизующие рамочные фильтры, добавляют 0,15% формалина и выдерживают при 39-40°С 15 суток, в течение которых токсин полностью переходит в анатоксин.
Следует отметить, что очистка и концентрация анатоксинов в условиях промышленного производства возможна не только с помощью метода кислотного осаждения. В ряде стран для этого используют методику ультрафильтрации и последующего фракционирования сульфатом аммония. Процесс детоксикации является наиболее ответственным этапом технологии получения анатоксинов. Полагают, что процесс детоксикации является следствием необратимого нарушения активного центра молекулы токсина в результате образования прочного соединения его функциональных групп с формалином. Полученный анатоксин вновь подвергают очистке, затем контролируют его безвредность на животных, после чего определяют антигенную и удельную активность - количество флоккулирующих единиц соответственно в 1 мл и на 1 мг белкового азота.
Если анатоксин удовлетворяет требованиям контроля, его используют для изготовления адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС), так называемого, АДС-М - анатоксина, содержащего уменьшенное количество антигенов и адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины (АКДС).
Иммуногенность адсорбированного препарата резко возрастает. Анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия при непрерывном перемешивании в течение 1 сут и температуре 4-10°С. Процесс производства дифтерийного анатоксина осуществляется с соблюдением условий стерильности.
Одна прививочная доза дифтерийного анатоксина объемом 0,5 мл содержит 30 флоккулирующих единиц (30 ЛФ).
В настоящее время дифтерийный анатоксин не применяется самостоятельно. Для вакцинации неиммунных детей и подростков, в т. ч. положительно реагирующих на внутрикожное введение дифтерийного токсина (реакция Шика), особенно в условиях неблагополучной эпидемической ситуации, например, во время групповых заболеваний дифтерией, единичные случаи которых, преимущественно среди подростков в организованных коллективах, к сожалению, еще регистрируются, используют АДС-М - анатоксин. Этот препарат в рамках календаря профилактических прививок применяют для плановой ревакцинации детей 6 и 11 лет, а также для вакцинации и ревакцинации детей, которым противопоказаны прививки АКДС-вакциной и АДС-анатоксином.
Основными противопоказаниями к вакцинации АДС и АДС-М анатоксинами являются повышенная температура, инфекционное заболевание и период реконвалесценции, недавно полученная прививка другой вакциной. Естественно, этими препаратами можно вакцинировать сразу же после снижения температуры, а также через 2 месяца после выздоровления либо ранее полученной прививки.
Эффективность вакцинации дифтерийным анатоксином общеизвестна. Так, по данным П. Н. Бургасова, к 1966 г., когда был достигнут достаточно широкий охват населения противодифтерийной иммунизацией, по сравнению с 1913 г. заболеваемость клинически выраженными и поддающимися регистрации формами дифтерии снизилась в 240 раз. В последующем, по мере улучшения состояния прививочного дела, наблюдалось неуклонное снижение заболеваемости дифтерией и к 1978 г. по сравнению с 1956 г. (до начала массовых прививок) частота регистрации случаев заболевания дифтерией снизилась в 763 раза. В настоящее время в стране регистрируются практически единичные случаи дифтерии в основном у непривитых лиц или не получивших полный курс им1мунизации по причине противопоказаний.
Важно запомнить, что возбудитель дифтерии, хотя и значительно менее интенсивно, чем в прошлом, циркулирует среди населения и продолжает с достаточно высокой частотой выделяться от практически здоровых людей с напряженным поствакцинальным антитоксическим иммунитетом. Поэтому даже при полном отсутствии больных прекращать прививки против дифтерии, в отличие от случая с оспой, очевидно, не следует. Отсюда, естественно, каждый непривитой человек по праву может рассматриваться как потенциальная жертва дифтерии. Возникновение заболевания дифтерией, особенно групповых случаев, должно расцениваться как объективный показатель наличия серьезных дефектов в состоянии прививочного дела.
В связи с изложенным можно заключить, что полноценная иммунизация дифтерийным анатоксином подлежащих ей контингентов населения является высокоэффективной противоэпидемической мерой поддержания стабильного эпидемического благополучия по этой инфекции.
Столбнячный анатоксин. История получения столбнячного и дифтерийного анатоксинов практически идентична. Вместе с тем особенности биологии возбудителя столбняка, относящегося к группе анаэробов, активность которых проявляется в отсутствии кислорода, определяет некоторую специфику производства столбнячного анатоксина.
В качестве культуры-продуцента токсина в нашей стране используют штаммы Колле № 154, 471, 473, а за рубежом - штамм Горвард № 49, 205. Так называемые маточные культуры перечисленных штаммов хранят преимущественно в лиофилизированном виде, хотя возможно их сохранение на жидких питательных средах типа Рамона или Глузмана при температуре 4-8°С в течение 6-18 мес. Перед использованием свойства длительно хранившейся культуры восстанавливают. Для этого ее вначале высевают на среду Китта-Тароцци, широко применяемую при культивировании анаэробов, а уже после этого пересевают на 2/г л казеиново-растительной - кислотно-гидролизатной среды, которую в последующем применяют также и для получения производственных серий анатоксина. После выдерживания посева в течение 24-48 ч при температуре 34°С получают свежеприготовленную "производственную" культуру. Такой последовательный пересев на специально подобранные питательные среды обеспечивает в последующем не только интенсивнее токсинообразование, но и получение полноценного токсина, обладающего набором всех специфических токсических и ферментных субстанций, играющих роль в патогенезе столбняка. Так, токсины тетаноспазмин и тетанолизин вызывают соответственно тетанический мышечный спазм (основной симптом столбняка) и оказывают кардиологическое и гемолитическое действие, а ферменты фибринолизин, рибонуклеаза и протеазы расщепляют высокомолекулярные соединения в тканях, способствуя тем самым распространению тетаноспазмина.
В условиях современного производства столбнячный токсин получают в специальных реакторах-культиваторах. Достаточно схематично последовательность технологии производства столбнячного анатоксина выглядит следующим образом. В предварительно простерилизованные реакторы различной емкости заливают от 250 до 500 л питательной среды, стерилизуют ее при температуре 112°С в течение 40-45 мин, быстро охлаждают до 45-50°С, что исключает насыщение среды кислородом, И засевают ранее подготовленной "производственной" культурой. Процесс токсинообразования осуществляется при заданном температурном режиме и сопровождается образованием пены и газа, за чем ведется визуальное наблюдение через смотровые окна. После завершения срока инкубации содержимое реактора пропускают через многорамные фильтрующе-стерилизующие устройства, и освобожденный от культуры раствор токсина переливают в реактор-детоксикатор, снабженный автоматической мешалкой. Затем с соблюдением определенного режима, нормализующего температуру, освещенность, доступ воздуха и другие параметры, влияющие на сохранение максимума антигенной активности токсина, к нему в зависимости от принятого варианта технологии добавляют формалин в количестве, необходимом либо для полного обезвреживания, либо для частичной детоксикации, требующей в последующем дополнительного обезвреживания.
По методике, отработанной еще Г. Рамоном, токсин полностью переходит в анатоксин в присутствии 0,35- 0,4% формалина при температуре 37-38°С в течение 21-25 суток. Установлено, что токсин можно обезвредить и в присутствии других альдегидов, например, глутарового, однако за пределы экспериментальных исследований эти приемы пока не вышли. И это вполне понятно, так как человечеством накоплен поистине огромный опыт, свидетельствующий о надежности детоксикации формалином и обеспечивающий полную безвредность получаемых анатоксинов. Полагают, что во время детоксикации одновременно идут два процесса, различающиеся по скорости, которая зависит от концентрации токсина: процесс обезвреживания и процесс стабилизации структуры молекулы анатоксина. Это учитывают при модификации технологии.
Полученный нативный анатоксин содержит балластные вещества из среды культивирования и микробных клеток, зачастую обладающие антигенными свойствами. Поэтому его очищают с помощью химических (например, осаждение солями), физико-химических (например, ионообменная хроматография) или физических (например, ультрафильтрация) методов. В нашей стране используется двухэтапная методика очистки столбнячного анатоксина путем его осаждения хлористоводородной кислотой в изоэлектрической точке при определенной концентрации хлористого натрия, сепарирования осадка, его разведения в физиологическом растворе и переосаждения ацетоном на холоде. Выпавший при этом очищенный анатоксин сепарируют и растворяют в заданном объеме физиологического раствора. Эта методика очистки и концентрации обеспечивает получение анатоксина с удельной активностью 600-900 единиц связывания (ЕС) на 1 мг белкового азота. Существуют и иные методы очистки, в частности, обеспечивающие больший выход антигена, - методы очистки и концентрации нативного либо частично обезвреженного токсина. Однако они сложнее описанного и, естественно, требуют специального оснащения. В случае получения производственной серии анатоксина с неудовлетворительно низкой антигенной активностью она может быть дополнительно очищена и сконцентрирована с помощью таких методов, как ультрафильтрация, гель-фильтрация, ионообменная хроматография.
Очищенный столбнячный анатоксин в нативном виде слабо иммуногенен и поэтому используется для изготовления адсорбированных препаратов (АС, АДС, АКДС). Сорбция анатоксина осуществляется таким образом, чтобы в 1 мл конечного продукта находилось 20 ЕС и не более 2,5 мг гидроокиси алюминия, так как одна прививочная доза (0,5 мл) не может содержать выше 1,25 мг сорбента. Затем адсорбированный анатоксин контролируют на:
- стерильность (отрицательные результаты посева на разные питательные среды);
- безвредность (получившие подкожно по 2,5 мл в бок и в лапку морские свинки массой 300-350 г в течение 3 недели должны оставаться здоровыми и прибавлять в массе тела);
- иммуногенность (однократное введение белым мышам по 0,1 мл - 2 ЕС - через 21 день должно обеспечить устойчивость не менее 50% животных к введению 50 так называемых минимальных смертельных доз столбнячного токсина).
С помощью национального стандарта иммуногенности, калиброванного по международному стандарту, прививая, а затем заражая белых мышей, определяют количество защитных (иммуногенных) единиц (ИЕ) в 1 мл препарата.
Готовый адсорбированный столбнячный анатоксин представляет собой бесцветную или с желтым оттенком гомогенную суспензию, оседающую при отстаивании, но быстро приходящую в исходное состояние при легком встряхивании без появления видимых частиц и хлопьев.
Срок годности препарата 3 года при условии его хранения в сухом темном месте при 3-10°С. Следует помнить, что в случае замерзания оттаявший препарат применяться не может.
Адсорбированный столбнячный анатоксин вводят внутримышечно шприцем или безыгольным инъектором. Разовая прививочная доза 10 ЕС в объеме 0,5 мл.
Основные противопоказания к иммунизации столбнячным анатоксином идентичны таковым при вакцинации дифтерийным анатоксином.
В отличие от дифтерии столбняк не относится к группе детских инфекционных болезней, поэтому его распространение не ограничивается определенной возрастной группой населения. Программа иммунопрофилактики столбняка в нашей стране наряду с вакцинацией детей АКДС-вакциной ранее включала в себя также и широкую иммунизацию на неблагополучных по столбняку территориях взрослых, относящихся к группам высокого риска, иными словами иммунизацию людей тех профессий, которые чаще лиц с иной специальностыо заболевали столбняком. Применение столбнячного анатоксина как такового или в составе различных ассоциированных вакцин оказалось высокоэффективным. Так, по данным П. Н. Бургасова, к 1973 г. заболеваемость столбняком по сравнению с данными 1950 "допрививочного" года снизилась в 6,2 раза. В последующем случаи заболевания столбняком регистрируются с каждым годом все реже и реже. Следует подчеркнуть, что возбудитель столбняка распространен практически повсеместно, причем в споровом состоянии длительно сохраняется в почве. Отсюда никакое благополучие по столбняку не должно сказываться на полноценном выполнении программы вакцинации подлежащего ей населения столбнячным анатоксином. Снижение бдительности медиков, участвующих в прививочной работе, в этом случае поистине смерти подобно.
Коклюшно-дифтерийно - столбнячная вакцина. Эта вакцина, применяющаяся в нашей стране для иммунопрофилактики коклюша, дифтерии и столбняка с 1965 г., полностью вытеснила ранее использовавшиеся в борьбе с коклюшем коклюшную моновакцину и ее ассоциацию с дифтерийным анатоксином.
КДС-вакцины, используемые в разных странах, отличаются по технологии производства и соотношению входящих в их состав антигенных компонентов, что обусловливает некоторые различия в результатах их применения. Поэтому целесообразно вначале рассмотреть основы технологии изготовления коклюшного компонента АКДС-вакцины, тем более что принципы производства дифтерийного и столбнячного анатоксинов были описаны ранее.
Коклюшная убитая корпускулярная вакцина готовится из штаммов коклюшных бактерий, находящихся в 1-й фазе, и соответствует по своим свойствам (морфологии, характеру роста на питательных средах, антигенной структуре, вирулентности, токсичности и им-муногенности) требованиям специальной инструкции. Отобранные для производства вакцины штаммы сохраняют в лиофилизированном состоянии при 4-10°С. Биомассу получают путем выращивания специально подготовленной (восстановленной и тщательно проверенной) культуры на полусинтетических жидких или плотных питательных средах, являющихся модификацией общеизвестных сред Коена и Уилера либо Хорнибрука.
В нашей стране для получения биомассы повсеместно используется среда КУА, предложенная в 1954 г. М. С. Захаровой и Н. А. Палкиной. В состав этой среды входят гидролизат казеина, минеральные соли, крахмал, хлорид аминокислоты цистеина, дрожжевой диализат, активированный уголь и агар-агар. При правильном приготовлении КУА выход массы коклюшных бактерий с 1 мл среды составляет не менее 20 международных единиц мутности (MEM). В производственных условиях среду КУА в горячем состоянии заливают в плоские бутыли - матрасы и после уплотнения агара на его поверхность наносят 3-4 мл суспензии свежеприготовленной восстановленной культуры густотой 70- 80 MEM в 1 мл и, покачивая, распределяют ее на всей площади среды. Засеянные матрасы укладывают посевом вниз и инкубируют при 35-36°С в течение 44- 48 ч, после чего выросших микробов смывают 50- 60 мл охлажденного до 10°С стерильного физиологического раствора. Затем взвесь коклюшных бактерий из многих матрасов сливают в большие 5-10-литровые бутыли. Полученную густую суспензию под контролем стандарта мутности доводят физиологическим раствором до 80-100 MEM в 1 мл, после чего добавляют формалин до концентрации 0,1% или мертиолат в соотношении 1 : 10 000, хорошо перемешивают путем утрясания бутыли в шуттель-аппарате и оставляют ее на сутки соответственно при 17-22°С (с формалином) или 35-36°С (с мертиолатом).
До сведения в АКДС-вакцину формалинизированная взвесь коклюшных бактерий хранится при 3-10°С не менее полутора месяцев, а мертиолатная не менее 3 мес.
В случае получения биомассы с жидкой питательной среды используют специальные ферментеры, где ряд заданных параметров в процессе выращивания микробов контролируется автоматикой. Массу микробов отделяют от питательной среды в сепараторах. В последние годы получен достаточно большой "выход" биомассы с синтетических питательных сред (50-70 MEM в 1 мл), причем иммуногенность бактерий, утраты которой опасались, оказалась очень высокой.
Конечным этапом является сведение воедино всех трех заранее проконтролированных компонентов вакцины. Это осуществляется в реакторах емкостью 200-250 л, снабженных мешалкой. Вначале одновременно проводят сорбцию дифтерийного и столбнячного анатоксинов, а затем приливают коклюшную вакцину, корригируя густоту взвеси микробов и содержание анатоксинов таким образом, чтобы в 1 мл было 20 MEM. (примерно 20 млрд. убитых формалином или мертиолатом коклюшных бактерий), 30 ЛФ дифтерийного и 10 ЕС столбнячного анатоксинов и не более 2 мг гидроокиси алюминия. После этого контролируют стерильность, безвредность, токсичность и иммуногенность каждого компонента, в том числе коклюшного, которая проверяется путем определения показателя выживаемости привитых АКДС-вакциной белых мышей, зараженных после этого вирулентной культурой возбудителя коклюша путем введения ее в мозг.
Если результаты контроля перечисленных свойств удовлетворяют существующим требованиям и в одной разовой прививочной дозе (0,5 мл) содержится не менее 4 международных защитных единиц (МЗЕ) коклюшного антигена, соответственно 30 и 60 иммунизирующих единиц (ИЕ) дифтерийного и столбнячного анатоксинов, вакцина может быть использована для людей.
Срок годности жидкой АКДС-вакцины полтора года (лиофилизированной АКДС-вакцины - 5 лет) при условии соблюдения температурного режима ее транспортировки и хранения в сухом темном месте при температуре 3-10°С.
АКДС-вакциной иммунизируют детей через 3 месяца после их рождения по определенной схеме, представленной в действующем календаре профилактических прививок.
Основными противопоказаниями к прививкам АКДС-вакциной являются те же, которые ранее перечислялись в связи с иммунизацией дифтерийным и столбнячным анатоксинами, а также тяжелые аллергические заболевания (бронхиальная астма и т. п.), так как коклюшному антигену присуще выраженное сенсибилизирующее действие. Устранение этого действия без ущерба для иммуногенности вакцинного препарата является одной из основных задач по его совершенствованию.
Применение коклюшной, а затем и АКДС-вакцины сопровождалось высоким эффектом. По данным П. Н. Бургасова, к 1966 г. по сравнению с 1913 г. заболеваемость манифестными формами коклюша снизилась более чем в 5 раз. В последующем по мере улучшения прививочного дела за счет увеличения полноты охвата иммунизацией подлежащих ей контингентов в сроки, регламентированные календарем профилактических прививок, заболеваемость коклюшем неуклонно снижалась. Так, к 1978 г. по сравнению с 1955 "допрививочным" годом заболеваемость снизилась в 57,3 раза. К тому же общеизвестно, что если привитой ребенок и заболеет коклюшем, он переносит его, как правило, в легкой форме.
Дифтерийный анатоксин. Возможность обезвреживания (детоксикации) дифтерийного токсина под действием формалина была установлена Сальковским еще в 1898 г. Затем Левенштейн и Эйслер в 1912 г. обнаружили, что обработанный формалином токсин утрачивает токсичность, сохраняя при этом высокую иммуногенную активность, так как его безболезненное введение экспериментальным животным сообщало состояние устойчивости к последующим инъекциям заведомо смертельных доз необезвреженного, так называемого нативного, токсина. Однако изготовление препарата, пригодного для иммунизации людей, по праву связывают с именем французского исследователя Г. Рамона, который разработал основы технологии производства и стандартизации дифтерийного и столбнячного анатоксинов с помощью специальных методов оценки их активности, что определило возможность выбора оптимальных прививочных дозировок и рациональной схемы вакцинации. Работы Г. Рамона позволили начать массовое изготовление и применение дифтерийного и столбнячного анатоксинов, что за сравнительно короткий период времени привело к резкому снижению заболеваемости дифтерией и столбняком во многих странах мира.
Начальным этапом технологии производства дифтерийного анатоксина является получение токсина дифтерийных микробов. В течение многих лет в качестве культуры микробов - продуцентов токсина используют выделенный в 1894 г. двумя исследователями и названный в их честь штамм Паркс-Вильямс-8 (PW-8), или, вернее, его разные варианты, адаптированные к разным условиям культивирования, принятым в той или иной стране. Так, в нашей стране используют вариант Массачусетс.
Для получения большого количества токсина подготовленную особым образом посевную культуру этих микробов засевают на жидкие питательные среды, содержащиеся в алюминиевых котлах - реакторах вместимостью до 80 л и более. При условии постоянного перемешивания и аэрирования стерильным воздухом рост микробов и продуцирование ими токсина осуществляется в таком реакторе особенно интенсивно. После 36-40 ч выращивания при 34-35°С содержимое реактора обрабатывается в суперцентрифугах для отделения раствора токсина от микробной массы. Затем токсин стерилизуют путем фильтрации и помещают в специальные реакторы или большие бутыли для частичной детоксикации. С этой целью к постоянно перемешиваемому токсину добавляют 0,6% формалина и выдерживают до 5 суток при 30-40°С. После этого частично обезвреженный токсин осаждают в основном с помощью трихлоруксусной кислоты, растворяют, очищают, стерилизуют фильтрацией, пропуская через фильтрующе-стерилизующие рамочные фильтры, добавляют 0,15% формалина и выдерживают при 39-40°С 15 суток, в течение которых токсин полностью переходит в анатоксин.
Следует отметить, что очистка и концентрация анатоксинов в условиях промышленного производства возможна не только с помощью метода кислотного осаждения. В ряде стран для этого используют методику ультрафильтрации и последующего фракционирования сульфатом аммония. Процесс детоксикации является наиболее ответственным этапом технологии получения анатоксинов. Полагают, что процесс детоксикации является следствием необратимого нарушения активного центра молекулы токсина в результате образования прочного соединения его функциональных групп с формалином. Полученный анатоксин вновь подвергают очистке, затем контролируют его безвредность на животных, после чего определяют антигенную и удельную активность - количество флоккулирующих единиц соответственно в 1 мл и на 1 мг белкового азота.
Если анатоксин удовлетворяет требованиям контроля, его используют для изготовления адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС), так называемого, АДС-М - анатоксина, содержащего уменьшенное количество антигенов и адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины (АКДС).
Иммуногенность адсорбированного препарата резко возрастает. Анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия при непрерывном перемешивании в течение 1 сут и температуре 4-10°С. Процесс производства дифтерийного анатоксина осуществляется с соблюдением условий стерильности.
Одна прививочная доза дифтерийного анатоксина объемом 0,5 мл содержит 30 флоккулирующих единиц (30 ЛФ).
В настоящее время дифтерийный анатоксин не применяется самостоятельно. Для вакцинации неиммунных детей и подростков, в т. ч. положительно реагирующих на внутрикожное введение дифтерийного токсина (реакция Шика), особенно в условиях неблагополучной эпидемической ситуации, например, во время групповых заболеваний дифтерией, единичные случаи которых, преимущественно среди подростков в организованных коллективах, к сожалению, еще регистрируются, используют АДС-М - анатоксин. Этот препарат в рамках календаря профилактических прививок применяют для плановой ревакцинации детей 6 и 11 лет, а также для вакцинации и ревакцинации детей, которым противопоказаны прививки АКДС-вакциной и АДС-анатоксином.
Основными противопоказаниями к вакцинации АДС и АДС-М анатоксинами являются повышенная температура, инфекционное заболевание и период реконвалесценции, недавно полученная прививка другой вакциной. Естественно, этими препаратами можно вакцинировать сразу же после снижения температуры, а также через 2 месяца после выздоровления либо ранее полученной прививки.
Эффективность вакцинации дифтерийным анатоксином общеизвестна. Так, по данным П. Н. Бургасова, к 1966 г., когда был достигнут достаточно широкий охват населения противодифтерийной иммунизацией, по сравнению с 1913 г. заболеваемость клинически выраженными и поддающимися регистрации формами дифтерии снизилась в 240 раз. В последующем, по мере улучшения состояния прививочного дела, наблюдалось неуклонное снижение заболеваемости дифтерией и к 1978 г. по сравнению с 1956 г. (до начала массовых прививок) частота регистрации случаев заболевания дифтерией снизилась в 763 раза. В настоящее время в стране регистрируются практически единичные случаи дифтерии в основном у непривитых лиц или не получивших полный курс им1мунизации по причине противопоказаний.
Важно запомнить, что возбудитель дифтерии, хотя и значительно менее интенсивно, чем в прошлом, циркулирует среди населения и продолжает с достаточно высокой частотой выделяться от практически здоровых людей с напряженным поствакцинальным антитоксическим иммунитетом. Поэтому даже при полном отсутствии больных прекращать прививки против дифтерии, в отличие от случая с оспой, очевидно, не следует. Отсюда, естественно, каждый непривитой человек по праву может рассматриваться как потенциальная жертва дифтерии. Возникновение заболевания дифтерией, особенно групповых случаев, должно расцениваться как объективный показатель наличия серьезных дефектов в состоянии прививочного дела.
В связи с изложенным можно заключить, что полноценная иммунизация дифтерийным анатоксином подлежащих ей контингентов населения является высокоэффективной противоэпидемической мерой поддержания стабильного эпидемического благополучия по этой инфекции.
Столбнячный анатоксин. История получения столбнячного и дифтерийного анатоксинов практически идентична. Вместе с тем особенности биологии возбудителя столбняка, относящегося к группе анаэробов, активность которых проявляется в отсутствии кислорода, определяет некоторую специфику производства столбнячного анатоксина.
В качестве культуры-продуцента токсина в нашей стране используют штаммы Колле № 154, 471, 473, а за рубежом - штамм Горвард № 49, 205. Так называемые маточные культуры перечисленных штаммов хранят преимущественно в лиофилизированном виде, хотя возможно их сохранение на жидких питательных средах типа Рамона или Глузмана при температуре 4-8°С в течение 6-18 мес. Перед использованием свойства длительно хранившейся культуры восстанавливают. Для этого ее вначале высевают на среду Китта-Тароцци, широко применяемую при культивировании анаэробов, а уже после этого пересевают на 2/г л казеиново-растительной - кислотно-гидролизатной среды, которую в последующем применяют также и для получения производственных серий анатоксина. После выдерживания посева в течение 24-48 ч при температуре 34°С получают свежеприготовленную "производственную" культуру. Такой последовательный пересев на специально подобранные питательные среды обеспечивает в последующем не только интенсивнее токсинообразование, но и получение полноценного токсина, обладающего набором всех специфических токсических и ферментных субстанций, играющих роль в патогенезе столбняка. Так, токсины тетаноспазмин и тетанолизин вызывают соответственно тетанический мышечный спазм (основной симптом столбняка) и оказывают кардиологическое и гемолитическое действие, а ферменты фибринолизин, рибонуклеаза и протеазы расщепляют высокомолекулярные соединения в тканях, способствуя тем самым распространению тетаноспазмина.
В условиях современного производства столбнячный токсин получают в специальных реакторах-культиваторах. Достаточно схематично последовательность технологии производства столбнячного анатоксина выглядит следующим образом. В предварительно простерилизованные реакторы различной емкости заливают от 250 до 500 л питательной среды, стерилизуют ее при температуре 112°С в течение 40-45 мин, быстро охлаждают до 45-50°С, что исключает насыщение среды кислородом, И засевают ранее подготовленной "производственной" культурой. Процесс токсинообразования осуществляется при заданном температурном режиме и сопровождается образованием пены и газа, за чем ведется визуальное наблюдение через смотровые окна. После завершения срока инкубации содержимое реактора пропускают через многорамные фильтрующе-стерилизующие устройства, и освобожденный от культуры раствор токсина переливают в реактор-детоксикатор, снабженный автоматической мешалкой. Затем с соблюдением определенного режима, нормализующего температуру, освещенность, доступ воздуха и другие параметры, влияющие на сохранение максимума антигенной активности токсина, к нему в зависимости от принятого варианта технологии добавляют формалин в количестве, необходимом либо для полного обезвреживания, либо для частичной детоксикации, требующей в последующем дополнительного обезвреживания.
По методике, отработанной еще Г. Рамоном, токсин полностью переходит в анатоксин в присутствии 0,35- 0,4% формалина при температуре 37-38°С в течение 21-25 суток. Установлено, что токсин можно обезвредить и в присутствии других альдегидов, например, глутарового, однако за пределы экспериментальных исследований эти приемы пока не вышли. И это вполне понятно, так как человечеством накоплен поистине огромный опыт, свидетельствующий о надежности детоксикации формалином и обеспечивающий полную безвредность получаемых анатоксинов. Полагают, что во время детоксикации одновременно идут два процесса, различающиеся по скорости, которая зависит от концентрации токсина: процесс обезвреживания и процесс стабилизации структуры молекулы анатоксина. Это учитывают при модификации технологии.
Полученный нативный анатоксин содержит балластные вещества из среды культивирования и микробных клеток, зачастую обладающие антигенными свойствами. Поэтому его очищают с помощью химических (например, осаждение солями), физико-химических (например, ионообменная хроматография) или физических (например, ультрафильтрация) методов. В нашей стране используется двухэтапная методика очистки столбнячного анатоксина путем его осаждения хлористоводородной кислотой в изоэлектрической точке при определенной концентрации хлористого натрия, сепарирования осадка, его разведения в физиологическом растворе и переосаждения ацетоном на холоде. Выпавший при этом очищенный анатоксин сепарируют и растворяют в заданном объеме физиологического раствора. Эта методика очистки и концентрации обеспечивает получение анатоксина с удельной активностью 600-900 единиц связывания (ЕС) на 1 мг белкового азота. Существуют и иные методы очистки, в частности, обеспечивающие больший выход антигена, - методы очистки и концентрации нативного либо частично обезвреженного токсина. Однако они сложнее описанного и, естественно, требуют специального оснащения. В случае получения производственной серии анатоксина с неудовлетворительно низкой антигенной активностью она может быть дополнительно очищена и сконцентрирована с помощью таких методов, как ультрафильтрация, гель-фильтрация, ионообменная хроматография.
Очищенный столбнячный анатоксин в нативном виде слабо иммуногенен и поэтому используется для изготовления адсорбированных препаратов (АС, АДС, АКДС). Сорбция анатоксина осуществляется таким образом, чтобы в 1 мл конечного продукта находилось 20 ЕС и не более 2,5 мг гидроокиси алюминия, так как одна прививочная доза (0,5 мл) не может содержать выше 1,25 мг сорбента. Затем адсорбированный анатоксин контролируют на:
- стерильность (отрицательные результаты посева на разные питательные среды);
- безвредность (получившие подкожно по 2,5 мл в бок и в лапку морские свинки массой 300-350 г в течение 3 недели должны оставаться здоровыми и прибавлять в массе тела);
- иммуногенность (однократное введение белым мышам по 0,1 мл - 2 ЕС - через 21 день должно обеспечить устойчивость не менее 50% животных к введению 50 так называемых минимальных смертельных доз столбнячного токсина).
С помощью национального стандарта иммуногенности, калиброванного по международному стандарту, прививая, а затем заражая белых мышей, определяют количество защитных (иммуногенных) единиц (ИЕ) в 1 мл препарата.
Готовый адсорбированный столбнячный анатоксин представляет собой бесцветную или с желтым оттенком гомогенную суспензию, оседающую при отстаивании, но быстро приходящую в исходное состояние при легком встряхивании без появления видимых частиц и хлопьев.
Срок годности препарата 3 года при условии его хранения в сухом темном месте при 3-10°С. Следует помнить, что в случае замерзания оттаявший препарат применяться не может.
Адсорбированный столбнячный анатоксин вводят внутримышечно шприцем или безыгольным инъектором. Разовая прививочная доза 10 ЕС в объеме 0,5 мл.
Основные противопоказания к иммунизации столбнячным анатоксином идентичны таковым при вакцинации дифтерийным анатоксином.
В отличие от дифтерии столбняк не относится к группе детских инфекционных болезней, поэтому его распространение не ограничивается определенной возрастной группой населения. Программа иммунопрофилактики столбняка в нашей стране наряду с вакцинацией детей АКДС-вакциной ранее включала в себя также и широкую иммунизацию на неблагополучных по столбняку территориях взрослых, относящихся к группам высокого риска, иными словами иммунизацию людей тех профессий, которые чаще лиц с иной специальностыо заболевали столбняком. Применение столбнячного анатоксина как такового или в составе различных ассоциированных вакцин оказалось высокоэффективным. Так, по данным П. Н. Бургасова, к 1973 г. заболеваемость столбняком по сравнению с данными 1950 "допрививочного" года снизилась в 6,2 раза. В последующем случаи заболевания столбняком регистрируются с каждым годом все реже и реже. Следует подчеркнуть, что возбудитель столбняка распространен практически повсеместно, причем в споровом состоянии длительно сохраняется в почве. Отсюда никакое благополучие по столбняку не должно сказываться на полноценном выполнении программы вакцинации подлежащего ей населения столбнячным анатоксином. Снижение бдительности медиков, участвующих в прививочной работе, в этом случае поистине смерти подобно.
Коклюшно-дифтерийно - столбнячная вакцина. Эта вакцина, применяющаяся в нашей стране для иммунопрофилактики коклюша, дифтерии и столбняка с 1965 г., полностью вытеснила ранее использовавшиеся в борьбе с коклюшем коклюшную моновакцину и ее ассоциацию с дифтерийным анатоксином.
КДС-вакцины, используемые в разных странах, отличаются по технологии производства и соотношению входящих в их состав антигенных компонентов, что обусловливает некоторые различия в результатах их применения. Поэтому целесообразно вначале рассмотреть основы технологии изготовления коклюшного компонента АКДС-вакцины, тем более что принципы производства дифтерийного и столбнячного анатоксинов были описаны ранее.
Коклюшная убитая корпускулярная вакцина готовится из штаммов коклюшных бактерий, находящихся в 1-й фазе, и соответствует по своим свойствам (морфологии, характеру роста на питательных средах, антигенной структуре, вирулентности, токсичности и им-муногенности) требованиям специальной инструкции. Отобранные для производства вакцины штаммы сохраняют в лиофилизированном состоянии при 4-10°С. Биомассу получают путем выращивания специально подготовленной (восстановленной и тщательно проверенной) культуры на полусинтетических жидких или плотных питательных средах, являющихся модификацией общеизвестных сред Коена и Уилера либо Хорнибрука.
В нашей стране для получения биомассы повсеместно используется среда КУА, предложенная в 1954 г. М. С. Захаровой и Н. А. Палкиной. В состав этой среды входят гидролизат казеина, минеральные соли, крахмал, хлорид аминокислоты цистеина, дрожжевой диализат, активированный уголь и агар-агар. При правильном приготовлении КУА выход массы коклюшных бактерий с 1 мл среды составляет не менее 20 международных единиц мутности (MEM). В производственных условиях среду КУА в горячем состоянии заливают в плоские бутыли - матрасы и после уплотнения агара на его поверхность наносят 3-4 мл суспензии свежеприготовленной восстановленной культуры густотой 70- 80 MEM в 1 мл и, покачивая, распределяют ее на всей площади среды. Засеянные матрасы укладывают посевом вниз и инкубируют при 35-36°С в течение 44- 48 ч, после чего выросших микробов смывают 50- 60 мл охлажденного до 10°С стерильного физиологического раствора. Затем взвесь коклюшных бактерий из многих матрасов сливают в большие 5-10-литровые бутыли. Полученную густую суспензию под контролем стандарта мутности доводят физиологическим раствором до 80-100 MEM в 1 мл, после чего добавляют формалин до концентрации 0,1% или мертиолат в соотношении 1 : 10 000, хорошо перемешивают путем утрясания бутыли в шуттель-аппарате и оставляют ее на сутки соответственно при 17-22°С (с формалином) или 35-36°С (с мертиолатом).
До сведения в АКДС-вакцину формалинизированная взвесь коклюшных бактерий хранится при 3-10°С не менее полутора месяцев, а мертиолатная не менее 3 мес.
В случае получения биомассы с жидкой питательной среды используют специальные ферментеры, где ряд заданных параметров в процессе выращивания микробов контролируется автоматикой. Массу микробов отделяют от питательной среды в сепараторах. В последние годы получен достаточно большой "выход" биомассы с синтетических питательных сред (50-70 MEM в 1 мл), причем иммуногенность бактерий, утраты которой опасались, оказалась очень высокой.
Конечным этапом является сведение воедино всех трех заранее проконтролированных компонентов вакцины. Это осуществляется в реакторах емкостью 200-250 л, снабженных мешалкой. Вначале одновременно проводят сорбцию дифтерийного и столбнячного анатоксинов, а затем приливают коклюшную вакцину, корригируя густоту взвеси микробов и содержание анатоксинов таким образом, чтобы в 1 мл было 20 MEM. (примерно 20 млрд. убитых формалином или мертиолатом коклюшных бактерий), 30 ЛФ дифтерийного и 10 ЕС столбнячного анатоксинов и не более 2 мг гидроокиси алюминия. После этого контролируют стерильность, безвредность, токсичность и иммуногенность каждого компонента, в том числе коклюшного, которая проверяется путем определения показателя выживаемости привитых АКДС-вакциной белых мышей, зараженных после этого вирулентной культурой возбудителя коклюша путем введения ее в мозг.
Если результаты контроля перечисленных свойств удовлетворяют существующим требованиям и в одной разовой прививочной дозе (0,5 мл) содержится не менее 4 международных защитных единиц (МЗЕ) коклюшного антигена, соответственно 30 и 60 иммунизирующих единиц (ИЕ) дифтерийного и столбнячного анатоксинов, вакцина может быть использована для людей.
Срок годности жидкой АКДС-вакцины полтора года (лиофилизированной АКДС-вакцины - 5 лет) при условии соблюдения температурного режима ее транспортировки и хранения в сухом темном месте при температуре 3-10°С.
АКДС-вакциной иммунизируют детей через 3 месяца после их рождения по определенной схеме, представленной в действующем календаре профилактических прививок.
Основными противопоказаниями к прививкам АКДС-вакциной являются те же, которые ранее перечислялись в связи с иммунизацией дифтерийным и столбнячным анатоксинами, а также тяжелые аллергические заболевания (бронхиальная астма и т. п.), так как коклюшному антигену присуще выраженное сенсибилизирующее действие. Устранение этого действия без ущерба для иммуногенности вакцинного препарата является одной из основных задач по его совершенствованию.
Применение коклюшной, а затем и АКДС-вакцины сопровождалось высоким эффектом. По данным П. Н. Бургасова, к 1966 г. по сравнению с 1913 г. заболеваемость манифестными формами коклюша снизилась более чем в 5 раз. В последующем по мере улучшения прививочного дела за счет увеличения полноты охвата иммунизацией подлежащих ей контингентов в сроки, регламентированные календарем профилактических прививок, заболеваемость коклюшем неуклонно снижалась. Так, к 1978 г. по сравнению с 1955 "допрививочным" годом заболеваемость снизилась в 57,3 раза. К тому же общеизвестно, что если привитой ребенок и заболеет коклюшем, он переносит его, как правило, в легкой форме.