Иммунологические данные при миастении
Сенсибилизация через ацетилхолиновые рецепторы. В 70-е годы вопрос о возможности индукции патологического процесса с помощью циркулирующего ингибитора стали рассматривать в качестве нового аспекта. При ксеногенной иммунизации животных материалом выделенных ацетилхолиновых рецепторов электрического угря или ската удалось вызвать иммунный ответ с развитием клинических, электрофизиологических и отчасти гистологических изменений, аналогичных наблюдаемым при миастении. В тестах с использованием таких рецепторов в 50% случаев была положительной РКС. В других реакциях - РПГА и преципитации - результаты были положительными только в отдельных случаях. Этот факт можно объяснить как различиями техники проведения эксперимента, так и довольно высокой специфичностью антител. Число положительных результатов значительно возрастает при использовании в RIAS ацетилхолиновых рецепторов крысы или человека. С их помощью удалось идентифицировать разные типы антител:
- к участку связывания нейротоксина;
- к детерминантам вне участка связывания токсина;
- к углеводным компонентам рецепторов (блокада связывания Кон А).
Идентифицировать Аг-структуру довольно сложно, поскольку сравнительно разным может быть взаимодействие между используемым бунгаротоксином и аутоАт, участок связывания для ацетилхолина и бунгаротоксина полностью неидентичен, а результаты эксперимента не всегда можно экстраполировать на характеристики рецепторов человека. Как показали многочисленные данные, в основе отмеченной гетерогенности лежит активность разных популяций антител. С помощью моноклональных антител в условиях эксперимента было установлено, что неблокирующие антитела вызывают более выраженные проявления, чем блокирующие. Практическое значение имеет выявление:
- блокирующих Ат: в зависимости от источника рецепторов это в 40-75% случаев положительный блокирующий тест,
- связывающих Ат (преципитация меченого комплекса рецепторов).
Высокочувствительным методом является также иммунопреципитация растворенных рецепторов. При этом радиоиммунном анализе положительные реакции наблюдают в 87-93% случаев. Одновременно он отличается высокой специфичностью. Незначительную корреляцию между показателями этих методов и тяжестью заболевания можно объяснить указанной гетерогенностью антител. Тем не менее это эффективный метод контроля за динамикой процесса, в частности при лечении плазмаферезом. Отрицательные результаты получают примерно в 10 (7-13) % случаев, что может быть обусловлено антителами к участкам связывания бунгаротоксина или формами миастении, вызванными другими причинами. Известны отдельные эксперименты на мышах по переносу заболевания для доказательства активности антител к рецепторам. Антитела к ацетилхолиновым рецепторам у здоровых лиц и при других патологических состояниях (включая заболевания нервной системы и поперечнополосатой мускулатуры) встречают крайне редко.
Антитела к антигенам поперечнополосатой мускулатуры. Циркулирующие антитела, специфически взаимодействующие со структурами поперечнополосатой мускулатуры, были впервые описаны Strauss и соавт. Авторы наблюдали интенсивную флюоресценцию поперечнополосатой мускулатуры человека или крысы при использовании в реакциях пула меченых глобулинов больных миастенией. В 35% случаев было выявлено связывание комплемента в мышечной ткани. В последующем эти данные были подтверждены другими авторами. Методом выбора для определения таких антител является непрямая иммунофлюоресценция. При разведении сыворотки 1:60 положительную реакцию наблюдают и при других заболеваниях, но при более высоких разведениях антитела обнаруживают только при миастении. В отдельных случаях их титр может превышать 1:100000. В ряде работ было отмечено, что поперечнополосатая мускулатура больных дает положительную реакцию в тесте прямой иммунофлюоресценции и без инкубации ткани с сывороткой. Этот феномен был отмечен не всеми исследователями, однако он свидетельствует о том, что в принципе соответствующие антитела могут реагировать с аутологичной тканью in vivo.
Более детальные исследования показали, что можно выделить по крайней мере 2 типа антител:
- антитела, связывающие комплемент, которые реагируют преимущественно с антигенами скелетной мускулатуры («S»);
- антитела, не связывающие комплемента, которые реагируют с антигенами как скелетной мускулатуры, так и миокарда («SH»).
Путем абсорбции нерастворимой в воде фракции сердечной мускулатуры можно полностью элиминировать SH-активность, а S-активность оставить без изменений. Соответствующие антигены присутствуют в мускулатуре других млекопитающих, а также птиц, рептилий и рыб. SH-антитела были выявлены у 25% больных миастенией, а S - у 5% и только при относительно высоком титре SH.
При сравнении данных иммунофлюоресценции с результатами фазово-контрастной и поляризационной микроскопии было установлено, что антитела локализуются прежде всего в латеральных участках А-дисков саркомер (анизотропных). В соответствующей области Н-зоны свечение отсутствует, При использовании изолированных миофибрилл оказалось, что у части больных сыворотки содержат антитела, реагирующие с Z-структурами между саркомерами. При сокращении мышечных волокон флюоресцентная картина А-дисков может сливаться с таковой Z-пластины и таким образом имитировать связывание в области 1-дисков (изотропных), хотя у некоторых больных, вероятно, содержатся антитела, реагирующие с 1-дисками.
Преимущественная локализация антител в области А-дисков дает основания предполагать, что в роли антигена может выступать миозин (в А-дисках содержатся актин и миозин, в норме в виде комплекса актомиозин-АТФ). Установить локализацию связывания антител субмикроскопически не удалось, так как меченные ферритином белковые молекулы могут неспецифически адсорбироваться. В области I-дисков антигенами могут быть актин и тропомиозин. Попытки определить антиген с помощью других методов дали противоречивые результаты. Исследования с применением более совершенной техники вновь напомнили о гипотезе нестабильности миозина, которая была выдвинута в результате опытов с экстрактами тканей. Миозин состоит из 2 Н и 5 L-цепей. Путем отделения L-цепей (нагревание до температуры выше 37 °С, высаливание сульфатом аммония) изменяются антигенные свойства миозина. Низкая антигенность актомиозина объясняется тем, что за счет связывания актина блокируется часть антигенных детерминант. L-цепи содержат АТФазу, а также участки для связывания АТФ и Са2+. Миозин и актомиозин могут абсорбировать SH-антитела, S-антитела, напротив, с ними не взаимодействуют. Эти антитела к структурам мышечной ткани могут быть причиной снижения функции тромбоцитов (в 5-50% случаев в зависимости от метода).
Перекрестные реакции с антигенами ткани вилочковой железы представляют интерес с патогенетической точки зрения. Сыворотки, которые реагируют с поперечнополосатой мускулатурой, в 95% случаев взаимодействуют и с антигенами ткани вилочковой железы. Путем абсорбции экстрактом ткани скелетной мускулатуры можно удалить или снизить активность сыворотки, т. е. ее способность реагировать с клетками вилочковой железы, в то время как абсорбция тканью вилочковой железы дает лишь частичный эффект и мало влияет на реакцию с антигенами поперечнополосатой мускулатуры. В отдельных случаях исследуемые сыворотки содержат антитела, способные реагировать только с одним из указанных антигенов. По-видимому, за активность перекрестно реагирующих антигенов поперечнополосатой мускулатуры и вилочковой железы ответственны «миоидные клетки», которые морфологически сходны с клетками мышечной ткани.
При миастении антитела к антигенам ткани поперечнополосатой мускулатуры встречаются нерегулярно. В зависимости от картины заболевания, активности процесса и методов определения их выявляют в 16-62% случаев. При отсутствии специального отбора больных их обнаруживают примерно в 30-48% случаев (эти и последующие данные получены с помощью техники непрямой иммунофлюоресценции; при сочетании нескольких методов в среднем их определяют в 50% случаев). Особенно часто такие антитела выявляют в начале заболевания, в стадии клинической активности, при особенно тяжелых формах течения процесса и при состояниях, сопровождаемых образованием тимом. После тимэктомии количество положительных реакций снижается с 46 до 17%; примечательно, что при тимомах эти показатели составляют от 83 до 75% соответственно. Определенное количество иммуноглобулинов связывается с мышечной тканью через Fc-фрагменты. У здоровых лиц истинные Ат к Аг скелетной мускулатуры выявляют только в 2-5% случаев, несколько чаще при различных поражениях мускулатуры (при полимиозите примерно в 18%), а при тимомах без миастении даже в 25%. Присутствие антител имеет ограниченное значение, однако их высокий титр (с клиническими проявлениями миастении или без них) может указывать на тимому. Эти данные утратили актуальность после выделения специфических антител к рецепторам для ацетилхолина.
Другие виды антител. Антинуклеарные факторы выявляют в 20(10-44)% случаев, антитела к антигенам ткани щитовидной железы - в 30 (15- 42)%. Чаще, чем в среднем у населения, сыворотки больных содержат антитела к компонентам слизистой оболочки желудка (6-16%) и РФ (0,5-10%). Примерно в 50% случаев определяются холодовые аутоАт, направленные против лимфоцитов. Т-супрессоры содержат многочисленные ацетилхолиновые рецепторы. Интерпретировать эти данные еще преждевременно. Эти иммунные феномены обнаруживают и у родственников больных. Пока неясно значение антител, реагирующих исключительно со структурами ядер нервных клеток (спинальных ганглиев).
Комплемент. В многочисленных исследованиях отмечалось, что примерно у 80% больных снижена общая гемолитическая активность системы комплемента. При обострениях процесса концентрация комплемента особенно снижена, в периоды ремиссии она, как правило, нормализуется, причем это не обусловлено терапией. В области концевой пластины могут быть обнаружены С3- и С9-компоненты комплемента.
Реакции клеточного типа. С помощью РТММ было установлено, что в 30-63% случаев при добавлении в тест-систему экстракта ткани скелетной мускулатуры индекс миграции был ниже 0,8. У отдельных больных наблюдали положительную реакцию и в тех случаях, когда антитела отсутствовали, однако при их высоком титре (метод непрямой иммунофлюоресценции) результаты всегда были положительными. При использовании свежевыделенного миозина получены аналогичные данные. Кожные пробы были положительными только в двух случаях из 17. Результаты РБТЛ оказались неоднозначными. Многие факты свидетельствуют о том, что речь идет о вторичных нарушениях. Примечательно, что лимфоциты вилочковой железы обладают аналогичной функциональной активностью. В 16-52% случаев угнетение миграции было вызвано антигенами ткани вилочковой железы.
Весьма информативными оказались исследования по изучению реакций клеточного иммунитета, обусловленных ответом на ацетилхолиновые рецепторы. Положительные реакции отмечены в 40-70% случаев (в малых сериях исследований до 100%), причем наблюдалась четкая корреляция с клиническими данными.
Применение кортикостероидов приводило к уменьшению симптоматики. Эти препараты также угнетали функциональную активность лимфоцитов. В большом числе случаев аналогичные результаты были получены при использовании рецепторов, выделенных из органов электрического угря. При других заболеваниях подобной сенсибилизации не наблюдалось.
Клинические указания на активацию конкретных субпопуляций Т-клеток еще отсутствуют, так что упомянутые процессы стимуляции могут быть обусловлены Т-хелперами.
Способность к иммунному ответу. При оценке иммунной системы отмечают, как правило, нормальные показатели или в отдельных случаях некоторое уменьшение количества или функциональной активности Т-клеток. Более четко выражен дефект Т-супрессоров, который при определенных условиях реакции может быть выявлен и в крови здоровых лиц, в частности при использовании сыворотки больных с миастенией. Дефект иммунорегуляторных клеток рассматривают как причину частого развития аутоиммунных процессов. Кроме того, в сыворотке больных повышена активность тимических факторов.
Примечательна функциональная активность лимфоцитов вилочковой железы, которые при миастении реагируют так же, как лимфоциты периферической крови (стимуляция митогеном ФГА, синтез иммуноглобулинов). Число В-клеток, которое в норме незначительно, при данной патологии сильно возрастает. Этот факт, а также возможность стимуляции лимфоцитов антигенами мышечной ткани свидетельствуют о том, что речь идет не о тимоцитах, а о лимфоцитах, рециркулирующих в вилочковую железу.
Читать далее Этиология и патогенез при миастении
- к участку связывания нейротоксина;
- к детерминантам вне участка связывания токсина;
- к углеводным компонентам рецепторов (блокада связывания Кон А).
Идентифицировать Аг-структуру довольно сложно, поскольку сравнительно разным может быть взаимодействие между используемым бунгаротоксином и аутоАт, участок связывания для ацетилхолина и бунгаротоксина полностью неидентичен, а результаты эксперимента не всегда можно экстраполировать на характеристики рецепторов человека. Как показали многочисленные данные, в основе отмеченной гетерогенности лежит активность разных популяций антител. С помощью моноклональных антител в условиях эксперимента было установлено, что неблокирующие антитела вызывают более выраженные проявления, чем блокирующие. Практическое значение имеет выявление:
- блокирующих Ат: в зависимости от источника рецепторов это в 40-75% случаев положительный блокирующий тест,
- связывающих Ат (преципитация меченого комплекса рецепторов).
Высокочувствительным методом является также иммунопреципитация растворенных рецепторов. При этом радиоиммунном анализе положительные реакции наблюдают в 87-93% случаев. Одновременно он отличается высокой специфичностью. Незначительную корреляцию между показателями этих методов и тяжестью заболевания можно объяснить указанной гетерогенностью антител. Тем не менее это эффективный метод контроля за динамикой процесса, в частности при лечении плазмаферезом. Отрицательные результаты получают примерно в 10 (7-13) % случаев, что может быть обусловлено антителами к участкам связывания бунгаротоксина или формами миастении, вызванными другими причинами. Известны отдельные эксперименты на мышах по переносу заболевания для доказательства активности антител к рецепторам. Антитела к ацетилхолиновым рецепторам у здоровых лиц и при других патологических состояниях (включая заболевания нервной системы и поперечнополосатой мускулатуры) встречают крайне редко.
Антитела к антигенам поперечнополосатой мускулатуры. Циркулирующие антитела, специфически взаимодействующие со структурами поперечнополосатой мускулатуры, были впервые описаны Strauss и соавт. Авторы наблюдали интенсивную флюоресценцию поперечнополосатой мускулатуры человека или крысы при использовании в реакциях пула меченых глобулинов больных миастенией. В 35% случаев было выявлено связывание комплемента в мышечной ткани. В последующем эти данные были подтверждены другими авторами. Методом выбора для определения таких антител является непрямая иммунофлюоресценция. При разведении сыворотки 1:60 положительную реакцию наблюдают и при других заболеваниях, но при более высоких разведениях антитела обнаруживают только при миастении. В отдельных случаях их титр может превышать 1:100000. В ряде работ было отмечено, что поперечнополосатая мускулатура больных дает положительную реакцию в тесте прямой иммунофлюоресценции и без инкубации ткани с сывороткой. Этот феномен был отмечен не всеми исследователями, однако он свидетельствует о том, что в принципе соответствующие антитела могут реагировать с аутологичной тканью in vivo.
Более детальные исследования показали, что можно выделить по крайней мере 2 типа антител:
- антитела, связывающие комплемент, которые реагируют преимущественно с антигенами скелетной мускулатуры («S»);
- антитела, не связывающие комплемента, которые реагируют с антигенами как скелетной мускулатуры, так и миокарда («SH»).
Путем абсорбции нерастворимой в воде фракции сердечной мускулатуры можно полностью элиминировать SH-активность, а S-активность оставить без изменений. Соответствующие антигены присутствуют в мускулатуре других млекопитающих, а также птиц, рептилий и рыб. SH-антитела были выявлены у 25% больных миастенией, а S - у 5% и только при относительно высоком титре SH.
При сравнении данных иммунофлюоресценции с результатами фазово-контрастной и поляризационной микроскопии было установлено, что антитела локализуются прежде всего в латеральных участках А-дисков саркомер (анизотропных). В соответствующей области Н-зоны свечение отсутствует, При использовании изолированных миофибрилл оказалось, что у части больных сыворотки содержат антитела, реагирующие с Z-структурами между саркомерами. При сокращении мышечных волокон флюоресцентная картина А-дисков может сливаться с таковой Z-пластины и таким образом имитировать связывание в области 1-дисков (изотропных), хотя у некоторых больных, вероятно, содержатся антитела, реагирующие с 1-дисками.
Преимущественная локализация антител в области А-дисков дает основания предполагать, что в роли антигена может выступать миозин (в А-дисках содержатся актин и миозин, в норме в виде комплекса актомиозин-АТФ). Установить локализацию связывания антител субмикроскопически не удалось, так как меченные ферритином белковые молекулы могут неспецифически адсорбироваться. В области I-дисков антигенами могут быть актин и тропомиозин. Попытки определить антиген с помощью других методов дали противоречивые результаты. Исследования с применением более совершенной техники вновь напомнили о гипотезе нестабильности миозина, которая была выдвинута в результате опытов с экстрактами тканей. Миозин состоит из 2 Н и 5 L-цепей. Путем отделения L-цепей (нагревание до температуры выше 37 °С, высаливание сульфатом аммония) изменяются антигенные свойства миозина. Низкая антигенность актомиозина объясняется тем, что за счет связывания актина блокируется часть антигенных детерминант. L-цепи содержат АТФазу, а также участки для связывания АТФ и Са2+. Миозин и актомиозин могут абсорбировать SH-антитела, S-антитела, напротив, с ними не взаимодействуют. Эти антитела к структурам мышечной ткани могут быть причиной снижения функции тромбоцитов (в 5-50% случаев в зависимости от метода).
Перекрестные реакции с антигенами ткани вилочковой железы представляют интерес с патогенетической точки зрения. Сыворотки, которые реагируют с поперечнополосатой мускулатурой, в 95% случаев взаимодействуют и с антигенами ткани вилочковой железы. Путем абсорбции экстрактом ткани скелетной мускулатуры можно удалить или снизить активность сыворотки, т. е. ее способность реагировать с клетками вилочковой железы, в то время как абсорбция тканью вилочковой железы дает лишь частичный эффект и мало влияет на реакцию с антигенами поперечнополосатой мускулатуры. В отдельных случаях исследуемые сыворотки содержат антитела, способные реагировать только с одним из указанных антигенов. По-видимому, за активность перекрестно реагирующих антигенов поперечнополосатой мускулатуры и вилочковой железы ответственны «миоидные клетки», которые морфологически сходны с клетками мышечной ткани.
При миастении антитела к антигенам ткани поперечнополосатой мускулатуры встречаются нерегулярно. В зависимости от картины заболевания, активности процесса и методов определения их выявляют в 16-62% случаев. При отсутствии специального отбора больных их обнаруживают примерно в 30-48% случаев (эти и последующие данные получены с помощью техники непрямой иммунофлюоресценции; при сочетании нескольких методов в среднем их определяют в 50% случаев). Особенно часто такие антитела выявляют в начале заболевания, в стадии клинической активности, при особенно тяжелых формах течения процесса и при состояниях, сопровождаемых образованием тимом. После тимэктомии количество положительных реакций снижается с 46 до 17%; примечательно, что при тимомах эти показатели составляют от 83 до 75% соответственно. Определенное количество иммуноглобулинов связывается с мышечной тканью через Fc-фрагменты. У здоровых лиц истинные Ат к Аг скелетной мускулатуры выявляют только в 2-5% случаев, несколько чаще при различных поражениях мускулатуры (при полимиозите примерно в 18%), а при тимомах без миастении даже в 25%. Присутствие антител имеет ограниченное значение, однако их высокий титр (с клиническими проявлениями миастении или без них) может указывать на тимому. Эти данные утратили актуальность после выделения специфических антител к рецепторам для ацетилхолина.
Другие виды антител. Антинуклеарные факторы выявляют в 20(10-44)% случаев, антитела к антигенам ткани щитовидной железы - в 30 (15- 42)%. Чаще, чем в среднем у населения, сыворотки больных содержат антитела к компонентам слизистой оболочки желудка (6-16%) и РФ (0,5-10%). Примерно в 50% случаев определяются холодовые аутоАт, направленные против лимфоцитов. Т-супрессоры содержат многочисленные ацетилхолиновые рецепторы. Интерпретировать эти данные еще преждевременно. Эти иммунные феномены обнаруживают и у родственников больных. Пока неясно значение антител, реагирующих исключительно со структурами ядер нервных клеток (спинальных ганглиев).
Комплемент. В многочисленных исследованиях отмечалось, что примерно у 80% больных снижена общая гемолитическая активность системы комплемента. При обострениях процесса концентрация комплемента особенно снижена, в периоды ремиссии она, как правило, нормализуется, причем это не обусловлено терапией. В области концевой пластины могут быть обнаружены С3- и С9-компоненты комплемента.
Реакции клеточного типа. С помощью РТММ было установлено, что в 30-63% случаев при добавлении в тест-систему экстракта ткани скелетной мускулатуры индекс миграции был ниже 0,8. У отдельных больных наблюдали положительную реакцию и в тех случаях, когда антитела отсутствовали, однако при их высоком титре (метод непрямой иммунофлюоресценции) результаты всегда были положительными. При использовании свежевыделенного миозина получены аналогичные данные. Кожные пробы были положительными только в двух случаях из 17. Результаты РБТЛ оказались неоднозначными. Многие факты свидетельствуют о том, что речь идет о вторичных нарушениях. Примечательно, что лимфоциты вилочковой железы обладают аналогичной функциональной активностью. В 16-52% случаев угнетение миграции было вызвано антигенами ткани вилочковой железы.
Весьма информативными оказались исследования по изучению реакций клеточного иммунитета, обусловленных ответом на ацетилхолиновые рецепторы. Положительные реакции отмечены в 40-70% случаев (в малых сериях исследований до 100%), причем наблюдалась четкая корреляция с клиническими данными.
Применение кортикостероидов приводило к уменьшению симптоматики. Эти препараты также угнетали функциональную активность лимфоцитов. В большом числе случаев аналогичные результаты были получены при использовании рецепторов, выделенных из органов электрического угря. При других заболеваниях подобной сенсибилизации не наблюдалось.
Клинические указания на активацию конкретных субпопуляций Т-клеток еще отсутствуют, так что упомянутые процессы стимуляции могут быть обусловлены Т-хелперами.
Способность к иммунному ответу. При оценке иммунной системы отмечают, как правило, нормальные показатели или в отдельных случаях некоторое уменьшение количества или функциональной активности Т-клеток. Более четко выражен дефект Т-супрессоров, который при определенных условиях реакции может быть выявлен и в крови здоровых лиц, в частности при использовании сыворотки больных с миастенией. Дефект иммунорегуляторных клеток рассматривают как причину частого развития аутоиммунных процессов. Кроме того, в сыворотке больных повышена активность тимических факторов.
Примечательна функциональная активность лимфоцитов вилочковой железы, которые при миастении реагируют так же, как лимфоциты периферической крови (стимуляция митогеном ФГА, синтез иммуноглобулинов). Число В-клеток, которое в норме незначительно, при данной патологии сильно возрастает. Этот факт, а также возможность стимуляции лимфоцитов антигенами мышечной ткани свидетельствуют о том, что речь идет не о тимоцитах, а о лимфоцитах, рециркулирующих в вилочковую железу.
Читать далее Этиология и патогенез при миастении