Определение столбнячного токсина в нервах
Определение токсина в нервах после его введения в периферические ткани может дать прямые доказательства неврального транспорта токсина в центральную нервную систему.
Начало этих исследований принято связывать с опытами Bruschettini, который после введения столбнячного токсина под кожу конечности находил его в седалищном нерве. Одновременно с Bruschettini и даже до него попытки обнаружить токсин в нервах и в головном мозгу были предприняты рядом авторов. Brunner нашел токсин в лицевом нерве человека, умершего от головного столбняка. В 1895 г. Gumprecht сделал первый небольшой обзор по этому вопросу, из которого явствовало, что хотя токсин и можно определить в нервах и (менее регулярно) в мозговой ткани, однако данные проведенных исследований в целом весьма противоречивы.
Первые достаточно определенные положительные результаты были получены Meyer, Meyer и Bansom и особенно Marie и Могах. После введения токсина Meyer обнаружил у больных или только что погибших животных токсин в седалищном нерве. Meyer и Bansom находили токсин в седалищном нерве у морской свинки после подкожного введения токсина. Введя токсин в заднюю конечность морской свинки, Marie систематически обнаруживал его в седалищном нерве. Этот автор показали, что при перерезке нерва токсин определяется только в периферическом отрезке и что, следовательно, он поступает в нерв из мышц. Токсин обнаруживается в нерве не ранее чем через час после введения в мышцы, а после перерезки нерва, уже содержащего токсин, количество последнего в центральном отрезке постепенно уменьшается, что связано с поступлением токсина в спинной мозг.
Исследования Marie сыграли важную роль в обосновании теории нейронального транспорта токсина в центральную нервную систему. Однако следующая работа этих же авторов осложнила понимание вопроса. Используя огромные дозы столбнячного токсина, Marie в опытах на пони, обезьяне и собаке установил, что столбнячный токсин может быть обнаружен в различных нервах, а также в различных тканях. Работа Marie подверглась критике даже сторонниками концепции неврального транспорта токсина. В частности, Meyer указывал, что в своих опытах Marie наблюдал не адсорбцию токсина, а поступление его в лимфатический аппарат нервов. Abel же с сотрудниками подчеркивали, что данные Marie свидетельствуют о возможности пропитывания нервов токсином в такой же мере, как и других органов.
Все последующие работы не дали окончательного решения этого вопроса. Наряду с положительными были получены и отрицательные результаты. Главная трудность заключалась в достоверном определении токсина в верхней части нерва, отдаленной от места введения. Doerr, Seidenberg и Magrassi и Trabattoni почти никогда не могли определить его здесь, даже при применении больших доз токсина. Lemetayer, вводя в мышцы конечности большие дозы токсина, находил его в седалищном нерве и на противоположной стороне, куда токсин, по мнению автора, поступал из крови.
Методическая сторона проведенных исследований подверглась серьезной критике со стороны Abel и сотрудников. Основные критические замечания сводятся к следующему.
1. В большинстве экспериментов седалищный нерв имплантировали мышам целиком или предварительно весь нерв перетирали и вводили кашицу. В этих условиях достаточно было наличия токсина только в нижней части нерва, куда он мог поступить в порядке пассивного пропитывания из места введения, чтобы имитировать содержание токсина во всем нерве. Следует отметить, что этот недостаток имеет место и в работах последнего времени.
2. Почти во всех экспериментах применялись очень большие дозы токсина, и поэтому нет гарантии в том, что токсин не поступает в нерв пассивно.
3. Помимо больших доз токсина, применялись также большие объемы вводимой жидкости. Даже объем в 0,5-1 мл является сравнительно большим, если учесть массу ткани, в которую токсин вводится. Однако объемы были значительно большими.
4. Исследования велись главным обрати на морских свинках и кроликах, т. е. на мелких лабораторных животных, благодаря чему создавались благоприятные условия для пропитывания токсином нерва. В тех же случаях, когда использовались крупные животные, применялись огромные дозы токсина, вследствие чего токсин мог быть обнаружен практически во всех тканях.
5. При определении токсина в нервах в большинстве случаев не изучалось содержание его в окружающих тканях. Когда же такое определение производилось, оказывалось, что мышцы, в которые вводится токсин, или мышцы, окружающие нерв, также токсичны. Эти данные также позволяют думать, что поступление токсина в нерв не отличается от его диффузии по другим тканям.
6. Определение токсина в нерве производилось, как правило, в поздние сроки, в ряде случаев после гибели животных. В инкубационном периоде содержание токсина в нервах не исследовалось. Клиника заболевания и содержание токсина в нервах не сопоставлялись. Поэтому нет никаких данных, которые бы свидетельствовали о динамике движения токсина по нерву и о связи этого движения с развитием заболевания.
7. Наконец, как указывает Doerr, следует обратить внимание на то, что токсин не удается обнаружить не только в соответствующем нерве, но также в конечном пункте гипотетического нервного распространения, а именно в центральной нервной системе.
Критика указанных работ была настолько серьезной, что создалось впечатление о бесплодности проведения подобных исследований. Derr и сотрудники поставили под сомнение возможность решения вопроса о невральном транспорте токсина с помощью биопроб. Richter и Schrechkenbach на основании обзора литературных данных также пришли к заключению, что с помощью старых классических методов исследования невозможно решить вопрос о путях распространения токсина. Первые же попытки использовать меченный изотопом токсин для изучения невральных путей его поступления в центральную нервную систему окончились неудачей.
Последние сообщения кажутся более обнадеживающими в отношении возможности применения меченого (тритием) токсина и методики флюоресцирующих антител с целью обнаружения токсина в нервном стволе.
Из приведенных выше данных видно, что вывод о невральном пути поступления столбнячного токсина в центральную нервную систему может быть обоснован при условии: 1) если наличие токсина в нервах будет показано с достоверностью; 2) если будет показано, что токсин поступает в нервы не в результате загрязнения или диффузного пропитывания нерва или его отдельных участков и не вследствие специальных условий опыта; 3) если будет доказано не только наличие токсина в нерве, но и движение по нерву; 4) если будет показана причинная связь между движением токсина по нерву и возникновением заболевания; 5) если будут получены аналогичные данные и установлены единые закономерности на животных различных видов. Эти принципиальные предпосылки определили общий план, конструкцию отдельных опытов и методические особенности проведенных нами исследований.
Задачи работы делали необходимым системное изучение содержания столбнячного токсина в различных отделах периферической нервной системы, обеспечивающей чувствительную и двигательную иннервацию мышц на стороне введения токсина, на противоположной стороне, а также в крови. Ряд необходимых условий опыта, предусматривающих возможность предохранения токсина от разрушения в процессе обработки тканей (гомогенизация тканей на холоду в присутствии стабилизаторов токсина и др.), обнаружение токсина по возможности в максимальных количествах в различных, в том числе и небольших по весу и размерам, нервных образованиях, использование в одном опыте одновременно нескольких (до 10) животных для исследования материала из различных отделов нервной системы, стандартные условия опытов и другие моменты позволили с достаточным успехом применить биопробы на мышах с целью обнаружения столбнячного токсина в различных отделах периферической нервной системы и получить достаточно стабильные результаты. Разработанная в специальных модельных опытах титрационная шкала дала возможность судить о количествах определяемого в тканях токсина
Исследования, проведенные первоначально на белых крысах, показали, что после введения токсина в мышцы голени токсин регулярно обнаруживается в седалищном нерве и в относящихся к нему передних корешках на стороне введения, т. е. на всем протяжении двигательных волокон, обеспечивающих иннервацию мышц голени, в которые был введен токсин. В этих же образованиях на противоположной стороне токсин не обнаруживается. Этот последний результат показывает, что на стороне введения токсин поступает в нервный тракт непосредственно из мышц. Относительно меньшее количество токсина в седалищном нерве по сравнению с соответствующими передними корешками свидетельствует о том, что в нервном стволе существуют структуры, не имеющие отношения к транспорту токсина. Передние же корешки представляют в этом отношении невральный путь в "чистом" виде. Кроме седалищного нерва, токсин обнаруживается, но в меньшем количестве, в бедренном и запирательном нервах. Это говорит о том, что токсин распространяется из места введения по соседним мышцам. В более поздние сроки токсин обнаруживается также и в спинальных ганглиях на стороне введения. Отсутствие его здесь в ранние сроки и во все сроки после введения на противоположной стороне позволяет заключить, что токсин поступает в ганглий по нерву и здесь накапливается. Об этом говорят и данные Fedinec, обнаружившего в опытах на мышах при помощи метода радиографии и флюоресцирующих антител наличие токсина в перикапсулярных пространствах вокруг отдельных нейронов ганглия.
Отсутствие столбнячного токсина в задних корешках наряду с его наличием в передних не связано с различием в сорбционных свойствах тканей корешков: эти свойства, как было установлено в специальных опытах, практически одинаковы. Если столбнячный токсин продвигается в нервном стволе и в пучках чувствительных волокон, то его отсутствие в задних корешках может быть связано с тем, что он задерживается в ганглиях. Однако двигается ли он по чувствительным волокнам, остается неизвестным. Не исключено, что в ганглии токсин может поступать и по оболочкам нерва.
Поступление токсина из мышцы в нерв не обусловлено введением больших количеств токсина или созданием в мышце повышенного давления вследствие введения в нее большого объема жидкости. Столбнячный токсин обнаруживается в нерве и в передних корешках после введения в мышцы и в относительно малых количествах, а также после введения токсина под кожу конечности. Последний факт свидетельствует также о том, что проникновение токсина в мышцы из подкожной клетчатки является обычным и одним из главных условий, при котором возникает заболевание.
Женский журнал www.BlackPantera.ru: Георгий Крыжановский
Начало этих исследований принято связывать с опытами Bruschettini, который после введения столбнячного токсина под кожу конечности находил его в седалищном нерве. Одновременно с Bruschettini и даже до него попытки обнаружить токсин в нервах и в головном мозгу были предприняты рядом авторов. Brunner нашел токсин в лицевом нерве человека, умершего от головного столбняка. В 1895 г. Gumprecht сделал первый небольшой обзор по этому вопросу, из которого явствовало, что хотя токсин и можно определить в нервах и (менее регулярно) в мозговой ткани, однако данные проведенных исследований в целом весьма противоречивы.
Первые достаточно определенные положительные результаты были получены Meyer, Meyer и Bansom и особенно Marie и Могах. После введения токсина Meyer обнаружил у больных или только что погибших животных токсин в седалищном нерве. Meyer и Bansom находили токсин в седалищном нерве у морской свинки после подкожного введения токсина. Введя токсин в заднюю конечность морской свинки, Marie систематически обнаруживал его в седалищном нерве. Этот автор показали, что при перерезке нерва токсин определяется только в периферическом отрезке и что, следовательно, он поступает в нерв из мышц. Токсин обнаруживается в нерве не ранее чем через час после введения в мышцы, а после перерезки нерва, уже содержащего токсин, количество последнего в центральном отрезке постепенно уменьшается, что связано с поступлением токсина в спинной мозг.
Исследования Marie сыграли важную роль в обосновании теории нейронального транспорта токсина в центральную нервную систему. Однако следующая работа этих же авторов осложнила понимание вопроса. Используя огромные дозы столбнячного токсина, Marie в опытах на пони, обезьяне и собаке установил, что столбнячный токсин может быть обнаружен в различных нервах, а также в различных тканях. Работа Marie подверглась критике даже сторонниками концепции неврального транспорта токсина. В частности, Meyer указывал, что в своих опытах Marie наблюдал не адсорбцию токсина, а поступление его в лимфатический аппарат нервов. Abel же с сотрудниками подчеркивали, что данные Marie свидетельствуют о возможности пропитывания нервов токсином в такой же мере, как и других органов.
Все последующие работы не дали окончательного решения этого вопроса. Наряду с положительными были получены и отрицательные результаты. Главная трудность заключалась в достоверном определении токсина в верхней части нерва, отдаленной от места введения. Doerr, Seidenberg и Magrassi и Trabattoni почти никогда не могли определить его здесь, даже при применении больших доз токсина. Lemetayer, вводя в мышцы конечности большие дозы токсина, находил его в седалищном нерве и на противоположной стороне, куда токсин, по мнению автора, поступал из крови.
Методическая сторона проведенных исследований подверглась серьезной критике со стороны Abel и сотрудников. Основные критические замечания сводятся к следующему.
1. В большинстве экспериментов седалищный нерв имплантировали мышам целиком или предварительно весь нерв перетирали и вводили кашицу. В этих условиях достаточно было наличия токсина только в нижней части нерва, куда он мог поступить в порядке пассивного пропитывания из места введения, чтобы имитировать содержание токсина во всем нерве. Следует отметить, что этот недостаток имеет место и в работах последнего времени.
2. Почти во всех экспериментах применялись очень большие дозы токсина, и поэтому нет гарантии в том, что токсин не поступает в нерв пассивно.
3. Помимо больших доз токсина, применялись также большие объемы вводимой жидкости. Даже объем в 0,5-1 мл является сравнительно большим, если учесть массу ткани, в которую токсин вводится. Однако объемы были значительно большими.
4. Исследования велись главным обрати на морских свинках и кроликах, т. е. на мелких лабораторных животных, благодаря чему создавались благоприятные условия для пропитывания токсином нерва. В тех же случаях, когда использовались крупные животные, применялись огромные дозы токсина, вследствие чего токсин мог быть обнаружен практически во всех тканях.
5. При определении токсина в нервах в большинстве случаев не изучалось содержание его в окружающих тканях. Когда же такое определение производилось, оказывалось, что мышцы, в которые вводится токсин, или мышцы, окружающие нерв, также токсичны. Эти данные также позволяют думать, что поступление токсина в нерв не отличается от его диффузии по другим тканям.
6. Определение токсина в нерве производилось, как правило, в поздние сроки, в ряде случаев после гибели животных. В инкубационном периоде содержание токсина в нервах не исследовалось. Клиника заболевания и содержание токсина в нервах не сопоставлялись. Поэтому нет никаких данных, которые бы свидетельствовали о динамике движения токсина по нерву и о связи этого движения с развитием заболевания.
7. Наконец, как указывает Doerr, следует обратить внимание на то, что токсин не удается обнаружить не только в соответствующем нерве, но также в конечном пункте гипотетического нервного распространения, а именно в центральной нервной системе.
Критика указанных работ была настолько серьезной, что создалось впечатление о бесплодности проведения подобных исследований. Derr и сотрудники поставили под сомнение возможность решения вопроса о невральном транспорте токсина с помощью биопроб. Richter и Schrechkenbach на основании обзора литературных данных также пришли к заключению, что с помощью старых классических методов исследования невозможно решить вопрос о путях распространения токсина. Первые же попытки использовать меченный изотопом токсин для изучения невральных путей его поступления в центральную нервную систему окончились неудачей.
Последние сообщения кажутся более обнадеживающими в отношении возможности применения меченого (тритием) токсина и методики флюоресцирующих антител с целью обнаружения токсина в нервном стволе.
Из приведенных выше данных видно, что вывод о невральном пути поступления столбнячного токсина в центральную нервную систему может быть обоснован при условии: 1) если наличие токсина в нервах будет показано с достоверностью; 2) если будет показано, что токсин поступает в нервы не в результате загрязнения или диффузного пропитывания нерва или его отдельных участков и не вследствие специальных условий опыта; 3) если будет доказано не только наличие токсина в нерве, но и движение по нерву; 4) если будет показана причинная связь между движением токсина по нерву и возникновением заболевания; 5) если будут получены аналогичные данные и установлены единые закономерности на животных различных видов. Эти принципиальные предпосылки определили общий план, конструкцию отдельных опытов и методические особенности проведенных нами исследований.
Задачи работы делали необходимым системное изучение содержания столбнячного токсина в различных отделах периферической нервной системы, обеспечивающей чувствительную и двигательную иннервацию мышц на стороне введения токсина, на противоположной стороне, а также в крови. Ряд необходимых условий опыта, предусматривающих возможность предохранения токсина от разрушения в процессе обработки тканей (гомогенизация тканей на холоду в присутствии стабилизаторов токсина и др.), обнаружение токсина по возможности в максимальных количествах в различных, в том числе и небольших по весу и размерам, нервных образованиях, использование в одном опыте одновременно нескольких (до 10) животных для исследования материала из различных отделов нервной системы, стандартные условия опытов и другие моменты позволили с достаточным успехом применить биопробы на мышах с целью обнаружения столбнячного токсина в различных отделах периферической нервной системы и получить достаточно стабильные результаты. Разработанная в специальных модельных опытах титрационная шкала дала возможность судить о количествах определяемого в тканях токсина
Исследования, проведенные первоначально на белых крысах, показали, что после введения токсина в мышцы голени токсин регулярно обнаруживается в седалищном нерве и в относящихся к нему передних корешках на стороне введения, т. е. на всем протяжении двигательных волокон, обеспечивающих иннервацию мышц голени, в которые был введен токсин. В этих же образованиях на противоположной стороне токсин не обнаруживается. Этот последний результат показывает, что на стороне введения токсин поступает в нервный тракт непосредственно из мышц. Относительно меньшее количество токсина в седалищном нерве по сравнению с соответствующими передними корешками свидетельствует о том, что в нервном стволе существуют структуры, не имеющие отношения к транспорту токсина. Передние же корешки представляют в этом отношении невральный путь в "чистом" виде. Кроме седалищного нерва, токсин обнаруживается, но в меньшем количестве, в бедренном и запирательном нервах. Это говорит о том, что токсин распространяется из места введения по соседним мышцам. В более поздние сроки токсин обнаруживается также и в спинальных ганглиях на стороне введения. Отсутствие его здесь в ранние сроки и во все сроки после введения на противоположной стороне позволяет заключить, что токсин поступает в ганглий по нерву и здесь накапливается. Об этом говорят и данные Fedinec, обнаружившего в опытах на мышах при помощи метода радиографии и флюоресцирующих антител наличие токсина в перикапсулярных пространствах вокруг отдельных нейронов ганглия.
Отсутствие столбнячного токсина в задних корешках наряду с его наличием в передних не связано с различием в сорбционных свойствах тканей корешков: эти свойства, как было установлено в специальных опытах, практически одинаковы. Если столбнячный токсин продвигается в нервном стволе и в пучках чувствительных волокон, то его отсутствие в задних корешках может быть связано с тем, что он задерживается в ганглиях. Однако двигается ли он по чувствительным волокнам, остается неизвестным. Не исключено, что в ганглии токсин может поступать и по оболочкам нерва.
Поступление токсина из мышцы в нерв не обусловлено введением больших количеств токсина или созданием в мышце повышенного давления вследствие введения в нее большого объема жидкости. Столбнячный токсин обнаруживается в нерве и в передних корешках после введения в мышцы и в относительно малых количествах, а также после введения токсина под кожу конечности. Последний факт свидетельствует также о том, что проникновение токсина в мышцы из подкожной клетчатки является обычным и одним из главных условий, при котором возникает заболевание.
Женский журнал www.BlackPantera.ru: Георгий Крыжановский