Приготовление экстрактов аллергенов при диагностике атопических заболеваний


Оптимальным методом обследования служит проба, при которой больной находится в контакте с предполагаемым аллергеном в естественных условиях окружающей среды (профессиональная деятельность, домашняя обстановка). При этом методы приготовления экстрактов и их стандартизация остаются основными проблемами практической аллергологии. Из-за отсутствия достаточного контроля и несоблюдения принципов стандартизации только в ряде случаев удалось идентифицировать по химическому составу аллерген, ответственный за клинические проявления. Таким образом, при диагностике атопических заболеваний чрезвычайно важно использовать более очищенные экстракты, не изменять стандартную технологию их приготовления.

Общие правила приготовления экстрактов. Техника приготовления экстрактов состоит из нескольких этапов.

Измельчение. Цель данного процесса - путем разрушения клеточных мембран увеличить общую поверхность исходного материала. Для этого используют миксер, приборы для воздействия ультразвуком и другую специальную аппаратуру. При значительном содержании жидкости (пища, в частности, фрукты) применяют соковыжималки и центрифуги. Особые технические трудности возникают при переработке таких материалов, как шерсть животных, перо, шелк и т. п.

Экстракция. Для этой цели используют слегка щелочную среду с рН 8,0, так как обычно в процессе экстракции рН раствора изменяется в кислую сторону. Чтобы колебания рН свести к минимуму, целесообразно работать с буферными растворами.

1. Щелочной раствор Coca наиболее пригоден для приготовления экстрактов из домашней пыли, грибов, пыльцы, мяса и рыбы.

2. Забуференный раствор NaCl рекомендуется для экстрактов из овощей, фруктов, эпидермиса, орехов и т. д.

3. Консервирующая жидкость для приготовления фруктовых и овощных соков. Добавляют в соотношении 1:4.

Для экстракции обезжиренный материал смешивают с указанными растворами, а затем помещают в тест-систему, где в течение 16-24 ч при комнатной температуре и постоянном встряхивании происходит процесс экстрагирования опытной смеси.

Техника Frugoni предусматривает экстракцию с помощью 12% раствора спирта (1 часть материала и 9 частей жидкости) в течение 48-72 ч в холодильнике.

Очистка. Исходный материал экстрагируют путем осаждения, центрифугирования или фильтрации. Основная техническая задача - получить по возможности большее количество очищенного экстракта и свести до минимума потери.

Диализ. Цель диализа состоит в том, чтобы удалить низкомолекулярные вещества и пигменты, которые могут вызвать нежелательные последствия в виде раздражения кожи. Данный метод необходим для экстракции домашней пыли, некоторых продуктов питания.

Каскадный способ фильтрации позволяет исключить и высокомолекулярные примеси.

Аллерген в качестве индивидуального препарата. Это высокоочищенный образец тест-препаратов получают с помощью моноклональных антител, что является предпосылкой для выделения исключительно major-аллергена. Преимущество использования этой техники было продемонстрировано при обследовании больных с аллергией к тимофеевке (антигены 19 и 25) и амброзии (Е-антиген). Другой подход к проблеме использования индивидуального препарата - приготовление смеси аллергенов, к которым проявляет повышенную чувствительность данное лицо. IgE-антител а больного при хроматографии связываются на колонках с аллергеном, и таким образом из грубого экстракта извлекают искомый препарат. Исследования в этом направлении еще продолжаются.

Стерилизация осуществляется путем фильтрации через бактериальные фильтры, после чего экстракт помещают в стерильную посуду. Перед его использованием проводят дополнительный контроль на стерильность - в культуральных условиях выявляют возможный рост анаэробных и аэробных микробов.

Проба на токсичность. Прежде всего, следует обратить внимание на рН: его показатель должен составлять около 7,0. Для определения нежелательного воздействия аллергена необходим строгий токсикологический и микробиологический контроль. Идеальный экстракт - это очищенный препарат с точным указанием количественного состава. Определенные шаги в этом направлении уже сделаны. Ниже представлены этапы приготовления экстрактов с разной степенью очистки.

I - Удаление веществ, вызывающих раздражение кожи. Биологический способ стандартизации и методы in vitro.

II - Идентификация и количественный анализ major-аллергена (маркера).

III - Идентификация и количественный анализ всех major- и minor-аллергенов.
IV - Удаление балластных веществ.

Стандартизация. Известны следующие подходы к стандартизации экстрактов.

1. Стандартизация с учетом исходной навески. При данном способе учитывают то количество исходного материала, из которого можно приготовить 1 мл экстракта необходимой концентрации. Единица Нуна - это тот объем аллергена, который можно экстрагировать из 0,001 мг пыльцы. Указанные параметры могут колебаться в зависимости от техники приготовления экстракта, поэтому данный способ не вполне надежен.

2. С помощью химического анализа. Данный вид стандартизации можно рассматривать как метод выбора при условии, что аллерген точно идентифицирован. Если исходить из того, что речь идет о белковом препарате, то единым критерием следует считать количество общего азота или азота белка. Несмотря на особую роль протеинов и протеидов, этот способ еще не стал общепринятым, тем не менее стандартизация, основанная на анализе экстрактов, более совершенна по сравнению с расчетом в единицах Нуна.

3. Определение активности ферментов (например, фосфолипазы при пчелином укусе или кислой фосфатазы при аллергии к злаковым).

4. Идентификация аллергенов-маркеров. Аллергены, вызывающие аллергию к пчелиному яду и амброзии, относятся к группе major. Стандартизация этих аллергенов-маркеров возможна с помощью иммунологических или химических методов. Наряду с этим было показано, что у отдельных больных эти маркерные аллергены не являются решающими для развития аллергии.

5. Биологическая стандартизация - сравнительный анализ результатов с использованием набора стандартных экстрактов предложена Storm van Leeuwen. Факт сенсибилизации (данные анамнеза) подтверждают следующие показатели:

- положительная проба с известными стандартными экстрактами;

- положительный PACT;

- кожная проба с гистамином (1 : 1000), проявляющаяся в виде волдыря диаметром 8 мм. С целью повышения воспроизводимости реакции целесообразно использовать 3 разные концентрации.

Реакции у 10 несенсибилизированных лиц должны быть отрицательными. Преимущество НЕР-стандартизации состоит в том, что можно сравнивать разные экстракты аллергенов по их биологической активности, которую можно контролировать с помощью лечебных мер. Следует более критично проводить отбор подходящих пробандов. -

6. Иммунологическая стандартизация основана на эффекте торможения PACT, реакции высвобождения гистамина и на использовании перекрестного радиоиммуноэлектрофореза. При реакции торможения PACT сравнивают те концентрации аллергенов, которые дают сходный ингибирующий эффект (обычно 50% торможение или ниже). Помимо количественной оценки, возможен и качественный анализ.

Стандартизация и контроль за качеством выпускаемых аллергенов - это проблема международного масштаба. Одна из основных задач - создание единых лекарственных препаратов - уже успешно разрабатывается.

Способы хранения экстрактов. Обычно экстракты аллергенов довольно нестабильны. Водные экстракты необходимо содержать в холодильнике при 4°С. При этом условии препараты сохраняют свои качества в течение 1 года. При комнатной температуре их активность относительно быстро снижается. Разведенный экстракт также быстро инактивируется в результате адсорбции на поверхности сосуда. Следует помнить, что содержание глицерина в тест-растворе не должно превышать 5%, иначе у больных возникает раздражение кожи.

Идентификация аллергенов. Методы стандартизации могут быть с успехом использованы для оценки активности аллергена, степени его очистки, а также для идентификации. ПРИЭФ - один из результативных методов. Прежде всего в агаре воспроизводят электрофоретическое разделение исследуемой смеси. Затем ставят rocket-иммуноэлектрофорез (двухмерная диффузия) в геле, содержащем преципитирующие антитела к смеси аллергенов (антисыворотки получают путем иммунизации экспериментальных животных). Один препарат подготавливают к окраске и последующей идентификации аллергенов в зависимости от «пиков» преципитации. В другой препарат вносят сыворотку от тех лиц, которые реагируют на смесь аллергенов. Затем с помощью сыворотки анти-IgE, меченной изотопом, определяют локализацию этих антител, чтобы обнаружить в разных фракциях соответствующие аллергены. С помощью ПРИЭФ были идентифицированы 37 антигенных фракций в экстракте амброзии, 10 из которых действовали как аллергены. В экстракте тимофеевки содержится более 30 антигенов, два из которых вызывают 80% торможение PACT. В экстракте Aspergillus fumigatus были идентифицированы 22 антигена, из них 4-5 аллергенов.

При обследовании значительного числа сенсибилизированных лиц можно составить аллергограмму экстракта. «Сильными» аллергенами (major) обозначены те фракции, которые вызывают сенсибилизацию у более чем 50% больных, «слабые» аллергены (minor) встречаются менее чем у 10% сенсибилизированных. С помощью этого анализа можно оптимизировать оценку экстрактов.


Еще по теме:




Ваше имя:
Защита от автоматических сообщений:
Защита от автоматических сообщений Символы на картинке: